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        補(bǔ)腎疏肝法對卵巢早衰大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響

        2021-07-08 09:21:50陳姝婷朱景茹卓澤偉王維斌郭明章
        福建中醫(yī)藥 2021年6期
        關(guān)鍵詞:性激素水平模型

        王 洋,陳姝婷,朱景茹,卓澤偉,張 斐,王維斌,郭明章

        (福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350122)

        卵巢早衰(primary ovarian failure,POF)是指 40 歲之前女性由于各種原因?qū)е侣殉矁?nèi)卵泡破壞或耗竭從而發(fā)生卵巢功能衰竭,以促性腺激素升高、雌激素水平降低為特征的一類疾病, 臨床以月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、潮熱、盜汗、陰道干澀等為主要表現(xiàn)[1-2]。 中醫(yī)并無POF 病名,根據(jù)其癥狀歸屬于“月經(jīng)量少”“經(jīng)閉”“血枯”“不孕”等范疇[3]。西醫(yī)認(rèn)為 POF 的發(fā)生主要與遺傳、自身免疫、代謝及醫(yī)源性損傷有關(guān),中醫(yī)學(xué)認(rèn)為POF 主要責(zé)之于腎精氣虧虛,肝郁氣滯,以致沖任虧虛,血海無源,發(fā)為本?。?]。有研究表明腎虛肝郁是造成卵巢早衰的主要病機(jī)[5-6],本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)腎疏肝法對POF 大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)作用以及對性激素的影響,以期為POF 的臨床防治提供理論依據(jù)。

        1 材 料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠共24 只,體質(zhì)量150~180 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供,許可證批號:SCXK(滬)2017-0005。 大鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 屏障系統(tǒng),控制溫度(24±2) ℃,濕度(55±10) %,自由攝食飲水,合格證編號:20170005005273。

        1.2 藥物 補(bǔ)腎疏肝方為左歸飲合柴胡疏肝散合方,處方:熟地黃 9 g,山藥 6 g,枸杞子6 g,茯苓4.5 g,山茱萸 6 g,柴胡 6 g,制陳皮 6 g,白芍 4.5 g,枳殼 4.5 g,川芎 4.5 g,醋香附 4.5 g,炙甘草 4.5 g。中藥飲片均由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院藥劑科提供,煎煮兩遍后用無菌紗布過濾3 次,濃縮至含生藥量0.693 g/mL 的湯劑。

        1.3 試劑及儀器 環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司,批號:S30563);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20201016);大鼠卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:M00272、ML002871、ML003375、ML003038);RM2245 型切 片 機(jī) (德 國Leica 公司);Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀(雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

        2 方 法

        2.1 分組與造模 將24 只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組和補(bǔ)腎疏肝組,每組8 只。 除空白對照組外,其余 2 組以 50 mg/(kg·d)的首負(fù)荷劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,再以 8 mg/(kg·d)環(huán)磷酰胺連續(xù)腹腔注射14 d,建立POF 大鼠模型。

        2.2 給藥方法 按照人與動物劑量常規(guī)換算法,即大鼠給藥劑量為人的6.3 倍計(jì)算,補(bǔ)腎疏肝組予補(bǔ)腎疏肝方湯劑 10 mL/(kg·d)灌胃,空白對照組和模型對照組予等體積生理鹽水灌胃,每日1 次,共4 周。

        2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食禁水12 h 后麻醉,剖腹取腹主動脈血,斷頭處死。 將卵巢周圍的脂肪和結(jié)締組織都剝離干凈,清洗卵巢殘血,將其置于4%多聚甲醛溶液固定后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?全血在室溫下靜置 3 h 后,3 000 r 離心 20 min, 抽提血清,分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。

        2.4 卵巢組織病理形態(tài)觀察 卵巢組織進(jìn)行梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、拷片,經(jīng)脫蠟、HE 染色、水化、封片后,在光鏡下觀察3 組大鼠卵巢病理形態(tài)學(xué)變化。

        2.5 血清 GnRH、GnRH-R、FSH、E2檢測 上述備用血清按照相應(yīng)ELISA 試劑盒說明書步驟操作后放入酶標(biāo)儀,用450 nm波長測定吸光度(OD 值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本實(shí)際濃度,檢測GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平。

        2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以()表示,采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。

        3 結(jié) 果

        3.1 3 組大鼠卵巢組織病理形態(tài) 空白對照組卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰,可見各級卵泡,顆粒細(xì)胞層次多;模型對照組卵巢組織體積減小,內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,閉鎖卵泡增多,成熟卵泡少;補(bǔ)腎疏肝組卵巢組織體積減小有所改善,閉鎖卵泡減少,可見各級卵泡。 見圖1。

        3.2 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平比較見表1。

        圖1 3 組大鼠卵巢組織HE 染色圖(×100)

        表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較()

        表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較()

        注:與空白對照組比較,1) P<0.01;與模型對照組比較,2) P<0.01,3) P<0.05。

        組別空白對照組模型對照組補(bǔ)腎疏肝組GnRH-R/(pg/mL)1567.83±154.52 564.90±184.031)752.49±169.172)n 8 8 8 GnRH/(mIU/mL)42.68±7.92 100.09±5.111)80.16±4.402)FSH/(IU/L)5.66±0.83 12.41±0.811)9.50±0.852)E2/(pmol/L)62.59±6.24 24.30±3.541)38.45±7.583)

        4 討 論

        目前卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床上缺乏統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)。 中醫(yī)強(qiáng)調(diào)“整體觀念”與“辨證論治”,從多角度、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)靈活運(yùn)用中藥,具有獨(dú)特的治療優(yōu)勢和廣闊的運(yùn)用前景[7]。 中醫(yī)認(rèn)為卵巢具有“藏泄”的雙重功能,功能發(fā)揮主要依靠腎的封藏與肝的疏泄作用,腎精虧虛、肝失疏泄是卵巢早衰的主要病機(jī)[8-9],因此,補(bǔ)腎疏肝法是防治POF 的關(guān)鍵。 補(bǔ)腎疏肝方由左歸飲合柴胡疏肝散組成。 左歸飲具有滋陰填精的功效,主治真陰不足證;柴胡疏肝散功能疏肝理氣,活血止痛,主治肝氣郁滯證。 二者合用,滋陰填精,疏肝行氣。

        下丘腦-垂體-卵巢軸能夠調(diào)節(jié)女性的性激素水平,從而維持正常的生殖功能。 GnRH 由下丘腦分泌,GnRH-R 作為G 蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員,可以介導(dǎo)GnRH 活性來調(diào)控垂體中FSH 的合成與分泌,使其到達(dá)卵巢后可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌E2,促進(jìn)子宮內(nèi)膜向增殖期轉(zhuǎn)變,加速卵巢卵泡的生長、發(fā)育、成熟以及排卵[10-11]。 FSH 是臨床常見的反映卵巢功能的指標(biāo),E2水平升高對垂體FSH 起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,中樞與外周之間形成有效的反饋與負(fù)反饋調(diào)節(jié),使女性性激素水平始終維持在動態(tài)的平衡狀態(tài)[12-13]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:① 補(bǔ)腎疏肝法能夠調(diào)節(jié)POF 大鼠性激素水平。 與空白對照組比較,模型對照組FSH 升高,E2降低,提示POF 大鼠模型建立成功。經(jīng)補(bǔ)腎疏肝法治療后的POF 大鼠血清FSH下降(P<0.01),E2升高(P<0.05),說明大鼠性激素水平紊亂得到一定改善,提高了卵巢對激素的敏感性。 ② 補(bǔ)腎疏肝法對POF 大鼠HPG 軸具有顯著調(diào)節(jié)作用。 POF 大鼠 GnRH 水平升高,GnRH-R 水平降低,排卵功能受到抑制。經(jīng)補(bǔ)腎疏肝法治療后,可明顯降低 POF 大鼠 GnRH 分泌水平(P<0.01),升高GnRH-R 分泌水平(P<0.05)。③ 補(bǔ)腎疏肝法能明顯改善POF 大鼠卵巢形態(tài)。 POF 大鼠卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,閉鎖卵泡增多,卵泡生長、成熟停滯。補(bǔ)腎疏肝法能改善卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu),使閉鎖卵泡減少,生長卵泡增加,同時促進(jìn)各級卵泡的成熟。

        綜上分析,補(bǔ)腎疏肝法治療POF 大鼠的作用機(jī)制可能與調(diào)控下丘腦-垂體-卵巢軸功能狀態(tài)從而調(diào)節(jié)大鼠性激素水平,糾正內(nèi)分泌紊亂,促進(jìn)卵巢修復(fù),卵泡生長、成熟有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳把芯苛搜a(bǔ)腎疏肝法對POF 大鼠病理形態(tài)和內(nèi)分泌激素水平的影響。 除此之外,本病發(fā)生是否還受其他基因的影響或調(diào)控,則有待進(jìn)一步深入研究。

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