程 瑛 ，陳曉萍 ，沈阿靈 ，李 捷 ，陳友琴 ，彭 軍 *

（1. 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3. 美國凱斯西儲大學醫(yī)學院，美國 克利夫蘭 44106）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），其特點是結(jié)腸黏膜的反復損傷和黏膜下層的慢性非特異性炎癥反應。 UC 發(fā)病率高，且呈逐年上升的趨勢，影響著全世界數(shù)百萬人的健康［1-2］。 UC 發(fā)病機制復雜，現(xiàn)有研究表明：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎性因子對UC 的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)控作用［3-8］。 精制保和顆粒（refined baohe granules，RBG）由中醫(yī)經(jīng)典處方保和丸精簡化裁而來，全方由神曲、紅藤、炒麥芽3 味藥配伍組成。神曲健脾和胃、消食化積，紅藤清熱解毒、散結(jié)消腫，炒麥芽行氣消食、健脾開胃，三者聯(lián)用共奏健脾和胃、化瘀解毒的功效。 然而RBG 對UC 的治療作用和機制尚未見報道，因此，本研究通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導構建 UC 小鼠模型， 探討 RBG 對UC 小鼠的治療作用及其可能的機制，以期為其臨床應用的二次開發(fā)提供進一步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 DM4000B 倒置顯微鏡、病理切片機（德國Leika 公司）；石蠟包埋機、生物組織自動脫水機（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司）；伊紅染色液、蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司）；一抗 IL-6 抗體、TNF-α 抗體（美國 GeneTex公司）；免疫組化試劑盒、diaminobenzidine（DAB）顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；DSS（美國 MP Biochemical 公司）；RBG（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號：1707310）。

1.2 實驗藥物配制

1.2.1 RBG 溶液配制 0.3 g RBG 用雙蒸水溶解配置成 150 mg／mL RBG 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 2% DSS 溶液配制 8 g DSS 粉末用雙蒸水溶解配制成 2% DSS 溶液，避光處理，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗動物 5 周齡 SPF 級雄性 C57BL／6 小鼠24 只，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2014-0017。 實驗期間，小鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心 SPF級實驗動物室，使用許可證號：SYXK（閩）2009-0001。

1.4 小鼠分組及給藥 將24 只體質(zhì)量、周齡相近的雄性C57BL／6 小鼠在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心適應性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分成對照組、RBG 組、DSS 組和 DSS+RBG 組，每組 6 只。RBG組自由飲用雙蒸水，同時給予0.2 mL RBG（藥物濃度為 1.5 g／kg）灌胃，每日 1 次，連續(xù)灌胃 11 d；DSS組自由飲用2% DSS 連續(xù)7 d 后換回自由飲用雙蒸水至11 d，同時給予等體積的雙蒸水灌胃11 d，每日1 次；DSS+RBG 組自由飲用 2% DSS 連續(xù) 7 d 后換回自由飲用雙蒸水至11 d，同時給予0.2 mL RBG灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃11 d；對照組自由飲用雙蒸水同時灌胃等體積的雙蒸水11 d，每日1 次。

1.5 疾病活動指數(shù)（DAI）評分檢測 每日測量小鼠體質(zhì)量，同時每2 d 檢測小鼠大便性狀、便血情況，參照文獻［9］，計算疾病活動指數(shù)（DAI）評分。

DAI 評分＝體質(zhì)量情況評分＋大便性狀情況評分＋便血情況評分

1.6 取材 給藥結(jié)束后，4 組小鼠經(jīng)1.5%異氟烷氣體麻醉取血；采用脫頸處死，冰上截取小鼠結(jié)腸，通過數(shù)碼相機對結(jié)腸組織進行拍照，直尺測量結(jié)腸長度，電子天平稱取結(jié)腸體質(zhì)量；隨后將結(jié)腸置于4%多聚甲醛中固定。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察結(jié)腸病理形態(tài)

4%多聚甲醛中固定24 h 后的結(jié)腸組織經(jīng)梯度乙醇進行脫水處理，之后二甲苯Ⅰ、Ⅱ進行透明，并依次放于石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行浸蠟處理后包埋；將結(jié)腸蠟塊切成 5 μm 薄片，烤片 2 h 后，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ進行脫蠟和梯度乙醇水化處理；雙蒸水沖洗后，進行蘇木素-伊紅溶液染色，晾干后樹脂膠封片處理。 用 Leica DM 4000B 顯微鏡采集（400×）圖像，觀察結(jié)腸病理形態(tài)。

1.8 免疫組化（IHC）染色檢測 IL-6 和 TNF-α 水平表達 石蠟切片按“1.7”項下水化處理后，抗原修復2～3 h，按照免疫組化試劑盒說明書，封閉1 h后，在4 ℃條件下過夜孵育一抗 IL-6 和 TNF-α（1∶200 稀釋）；第2 日石蠟切片給予相應的二抗孵育30 min，接著用稀釋液鏈霉親和素-POD 工作液孵育1 h；PBS 清洗后進行DAB 染色和蘇木素復染，水洗干后封片。 每組標本用Leica DM 4000B 顯微鏡隨機采集5 個高倍鏡視野（400×）圖像，采用Image-pro plus 7.0 軟件進行分析統(tǒng)計。 按Fromowitz綜合計分法，計算不同代表圖的陽性率平均值。陽性率平均值＜5%者為0 分；≥5%，＜25%為1 分；≥25%，＜50%者為2 分；≥50%，＜75%者為3 分；≥75%者為4 分。細胞染色強度的評定以染色深度判定：陰性為0 分，淺黃色但明顯強于陰性對照者為1 分，黃色為 2 分，棕黃色為 3 分。 上述兩項乘積為免疫組化評分［10］。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 計量資料服從正態(tài)分布者以（）表示，采用單因素方差分析中的LSD-t 法（方差齊）或Games-Howell 法（方差不齊）進行檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 4 組小鼠體質(zhì)量減輕率比較 結(jié)果見圖 1。 與對照組比較，RBG 組小鼠體質(zhì)量無顯變化，而DSS組小鼠體質(zhì)量明顯減輕；與DSS 組比較，DSS+RBG組小鼠體質(zhì)量無明顯變化。

圖1 4 組小鼠的體質(zhì)量減輕率比較

2.2 4 組小鼠 DAI 評分比較 結(jié)果見圖 2。與對照組比較，RBG 組 DAI 評分無變化，而 DSS 組 DAI 評分明顯升高；與 DSS 組比較，DSS+RBG 組 DAI 評分顯著降低。

圖2 4 組小鼠的DAI 評分比較

2.3 4 組小鼠結(jié)腸長度和體質(zhì)量比較 結(jié)果見圖3～圖5。 與對照組比較，RBG 組小鼠的糞便形狀，以及結(jié)腸長度和體質(zhì)量無變化，而DSS 組小鼠糞便不成型，且結(jié)腸長度明顯縮短，體質(zhì)量明顯減輕；與DSS 組比較，DSS+RBG 組小鼠糞便不成型，結(jié)腸長度縮短和體質(zhì)量減輕情況緩解。

圖3 4 組小鼠結(jié)腸長度照片圖

2.4 4 組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學比較 結(jié)果見圖6。與對照組比較，RBG 組小鼠的結(jié)腸組織形態(tài)學無顯著改變，而DSS 組小鼠的結(jié)腸黏膜紊亂，隱窩扭曲并有炎性細胞浸潤；與DSS 組比較，DSS+RBG 組DSS鼠結(jié)腸組織黏膜紊亂改善。

圖6 4 組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學光鏡圖（×200）

2.5 4 組小鼠結(jié)腸組織中IL-6 水平比較 結(jié)果見圖7。 與對照組比較，RBG 組小鼠結(jié)腸組織IL-6 水平無顯著變化，而DSS 組小鼠結(jié)腸組織中IL-6 水平明顯上升；與DSS 組比較，DSS+RBG 組小鼠結(jié)腸組織IL-6 水平下降。

圖7 4 組小鼠結(jié)腸組織中IL-6 免疫組化代表圖及免疫組化評分比較

2.6 4 組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α 水平比較 結(jié)果見圖8。 與對照組比較，RBG 組小鼠結(jié)腸組織TNF-α 水平無變化，而DSS 組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α水平明顯上升；與DSS 組比較，DSS+RBG 組小鼠結(jié)腸組織TNF-α 水平下降。

3 討 論

現(xiàn)有的研究已經(jīng)表明DSS 誘導的小鼠UC 模型可表現(xiàn)出與人類 UC 相似的癥狀［11］。 DAI 評分、大便性狀、結(jié)腸長度、體質(zhì)量以及結(jié)腸的組織形態(tài)學改變等可直觀反映疾病的進展情況，是臨床上評價UC 炎癥進程的重要指標［12］，因此本研究首先探討了RBG對DSS 誘導的小鼠UC 臨床癥狀的影響。 結(jié)果顯示：RBG 可顯著改善DSS 誘導的UC 小鼠的相關臨床癥狀，包括DAI 評分增加、結(jié)腸縮短和結(jié)腸體質(zhì)量減輕；與此同時，RBG 干預可改善結(jié)腸隱窩上皮變形、杯狀細胞丟失、炎性細胞浸潤和炎性反應，進而可緩解結(jié)腸黏膜和黏膜下層的組織病理學損傷。 由此可見，RBG 可通過緩解UC 的臨床癥狀來發(fā)揮其治療作用。

圖8 4 組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α 免疫組化代表圖及免疫組化評分比較

UC 發(fā)病原因復雜多樣，至今尚未明確闡明。 但現(xiàn)有的研究表明與多種促炎細胞因子相關［13－14］，其中TNF-α、IL-6 等炎性因子對UC 的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用［6］。 在 UC 進程中，中性粒細胞、巨噬細胞和T 淋巴細胞等免疫細胞的活化增加，會導致促炎細胞因子（IL-6、TNF-α 等）的產(chǎn)生增加，從而進一步損害結(jié)腸黏膜，是UC 發(fā)生發(fā)展的重要因素［15-18］。 所以，我們進一步探討了 RBG 對結(jié)腸組織中促炎癥細胞因子表達的影響，研究結(jié)果顯示：RBG干預可顯著抑制DSS 誘導引起的促炎因子IL-6 和TNF-α 水平。 綜上所述，RBG 通過抑制炎癥因子IL-6 和TNF-α 在UC 結(jié)腸組織中的表達，這可能是其發(fā)揮治療UC 的作用機制之一。