嚴(yán)皓哲，王勇興，貝 藝

(普陀醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 舟山 316100)

胃潰瘍可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹痛、反酸、噯氣、嘔血、便血，甚至胃穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥。部分患者由于胃潰瘍遷延不愈，可進一步惡化為胃癌，嚴(yán)重威脅患者的生命健康安全[1]。針對胃潰瘍的抗生素結(jié)合胃黏膜保護劑、抑酸藥物等三聯(lián)治療方案取得了一定的治療效果，但胃潰瘍的發(fā)生率依然居高不下[2]。相較于miRNA等其他非編碼RNA，長鏈非編碼RNA的生物學(xué)作用復(fù)雜，具有調(diào)控多種基因和其他非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白翻譯前、翻譯后修飾，功能蛋白轉(zhuǎn)運和定位等作用[3-4]。大量研究[5]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA參與機體生長發(fā)育和多種疾病的發(fā)生，幽門螺桿菌感染是導(dǎo)致胃潰瘍發(fā)生的重要因素。本研究探討長鏈非編碼RNA MIAT在幽門螺桿菌感染胃潰瘍中的表達意義和作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-DETA、青霉素-鏈霉素等均購自Hyclone公司，彎曲桿菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Trizol、Lipofectamine 3000購自Thermo公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa公司，CCK-8細胞活力檢測試劑盒、Annexin V-FITC/ PI流式凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物科技有限公司，IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自R&D公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自冠森生物科技(上海)有限公司，倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，紫外分光光度計購自梅特勒-托利多國際有限公司，實時熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司，流式細胞儀購自BD公司。

1.2 一般資料 收集2016年1月—2018年12月普陀醫(yī)院幽門螺桿菌感染的胃潰瘍患者120例及經(jīng)胃鏡檢查胃黏膜正常的患者100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃潰瘍患者經(jīng)胃鏡檢查和胃黏膜病理診斷確診為胃潰瘍；②胃黏膜正?；颊呓?jīng)胃黏膜病理檢查診斷胃黏膜正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在胃炎、胃間質(zhì)瘤、胃惡性腫瘤等胃腸道其他疾病患者；②存在慢性感染、免疫功能障礙或其他可影響治療觀察指標(biāo)的疾病患者；③存在心肺功能不全、肝腎功能障礙等內(nèi)外科嚴(yán)重疾病患者。胃潰瘍組男60例，女60例；年齡20～60歲，平均(35.6±8.7)歲。正常組男50例，女50例；年齡20～60歲，平均(35.2±8.1)歲。兩組研究對象年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部研究對象均簽署知情同意書。

1.3 細胞和幽門螺桿菌培養(yǎng) 人胃黏膜上皮細胞GES-1購自中科院上海細胞庫，采用含10% 胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。全部細胞學(xué)實驗傳代次數(shù)小于10次。幽門螺桿菌(H.pylori)購自美國National Collection of Type Culture(國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637)。采用一次性涂布器將對數(shù)生長期的幽門螺桿菌液100 μL(2×107CFU/mL)均勻接種至彎曲桿菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于85% N2、10% CO2和5% O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細菌置入無菌PBS中獲取細菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷醿x檢測幽門螺桿菌菌液濃度。

1.4 胃黏膜損傷模型構(gòu)建 分別以感染復(fù)數(shù)(MOI)1∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1的劑量培養(yǎng)GES-1細胞和幽門螺桿菌24 h。采用CCK-8檢測細胞活性，計算IC50，作為幽門螺桿菌感染造模的MOI值[6]。

1.5 組織、血漿和細胞RNA提取 胃鏡活檢時夾取研究對象5 mm潰瘍或正常組織2～3塊。于胃鏡檢查前抽取肘靜脈血2 mL，置EDTA抗凝管中，4℃ 1 200 g離心10 min，收集上清血漿。收集生長狀態(tài)良好的GES-1細胞加入1 mL Trizol混勻。組織、血漿和細胞RNA提取均采用Trizol法[7]。

1.6 實時熒光定量PCR 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除總RNA中殘留的基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA，反應(yīng)體系20 μL，按照試劑盒說明書步驟進行。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，94℃ 10 min，(94℃ 15 s，60℃ 1 min)持續(xù)40個循環(huán)。引物均由北京博邁德生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，采用GAPDH mRNA 為內(nèi)參。引物： MIAT: F: 5’-TTACTTTAACAGACCAGAA-3’, R’: 5’-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3’；GAPDH: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，R:5’-GCAGGAGG CATTGCTGATGAT-3’。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染 MIAT過表達質(zhì)粒(MIAT-OE)和MIAT-empty vector陰性對照空載體(MIAT-EV)由上海吉瑪生物科技有限公司協(xié)助設(shè)計并合成。選取生長狀態(tài)良好的GES-1細胞，胰酶消化并充分重懸細胞，以5×105接種至6孔板中。采用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染MIAT-OE和MIAT-EV至GES-1細胞，轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取RNA。采用實時熒光定量PCR檢測MIAT的表達效果。

1.8 細胞活性 采用CCK-8試劑盒檢測GES-1細胞活性。GES-1細胞以100 μL(3×103個細胞)接種于96孔培養(yǎng)板中，同時加入100 μL不含細胞的DMEM培養(yǎng)基作為空白對照組，每組4個重復(fù)孔。持續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃繼續(xù)孵育3 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長的吸光度值(A)，計算細胞存活率。細胞存活率(%) =(A轉(zhuǎn)染-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.9 細胞凋亡檢測 分別向6孔培養(yǎng)板每孔中接入5×105個生長狀態(tài)良好的正常GES-1細胞，生長至匯合度90%時采用不含EDTA的胰酶充分消化細胞，獲取單細胞懸液，依次加入5 μL Annexin V-FITC+PI避光孵育15 min，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.10 炎癥因子水平檢測 收集細胞培養(yǎng)上清液，12 000 g離心10 min后取上清液。采用IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒檢測，按照試劑盒說明書步驟進行。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 全部實驗重復(fù)3次，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIAT在幽門螺桿菌感染胃潰瘍患者中的表達 胃潰瘍組潰瘍組織和血漿的MIAT的表達水平均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。120例胃潰瘍患者中，76例為幽門螺桿菌陽性。幽門螺桿菌陽性的胃潰瘍患者的潰瘍組織和血漿中的MIAT表達水平均低于幽門螺桿菌陰性的胃潰瘍患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

***P<0.001。圖1 MIAT在幽門螺桿菌感染胃潰瘍患者中的表達Figure 1 The expression of MIAT in patients with gastric ulcer infected by Helicobacter pylori

2.2 幽門螺桿菌感染胃潰瘍模型的構(gòu)建 分別向GES-1細胞中加入不同MOI的幽門螺桿菌處理，培養(yǎng)24 h后，經(jīng)CCK-8檢測，發(fā)現(xiàn)隨著MOI的升高，細胞增殖逐漸降低。據(jù)此計算IC50，MOI=116.32∶1，見圖2a。以MOI=116.32∶1為幽門螺桿菌感染的MOI值，培養(yǎng)24 h，檢測GES-1細胞中MIAT的表達。幽門螺桿菌感染后GES-1細胞的MIAT表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖2b。

a: CCK-8檢測幽門螺桿菌感染后GES-1細胞的增殖；b: 實時熒光定量PCR檢測幽門螺桿菌感染后GES-1細胞的MIAT表達；***P<0.001, **P<0.01, * P<0.05。圖2 幽門螺桿菌感染胃潰瘍模型的構(gòu)建Figure 2 Construction of Helicobacter pylori infection gastric ulcer model

2.3 過表達MIAT對幽門螺桿菌感染的GES-1細胞增殖的影響 MIAT過表達轉(zhuǎn)染后的GES-1細胞的MIAT表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖3a。感染幽門螺桿菌72、96、120 h后，GES-1細胞增殖均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MIAT后，HP感染的GES-1細胞的增殖均高于未轉(zhuǎn)染MIAT的GES-1細胞和未轉(zhuǎn)染MIAT的HP感染的GES-1細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3b。

a: 實時熒光定量PCR檢測GES-1細胞的MIAT表達；b: CCK-8檢測GES-1細胞的增殖；* P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖3 過表達MIAT對幽門螺桿菌感染的 GES-1細胞增殖的影響Figure 3 The effect of overexpression of MIAT on the proliferation of Helicobacter pylori-infected GES-1 cells

2.4 過表達MIAT對幽門螺桿菌感染的GES-1細胞凋亡的影響 感染幽門螺桿菌后，GES-1細胞的凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MIAT后，HP感染的GES-1細胞的凋亡率均低于未轉(zhuǎn)染MIAT的GES-1細胞和未轉(zhuǎn)染MIAT的HP感染的GES-1細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

***P<0.001。圖4 過表達MIAT對幽門螺桿菌感染的 GES-1細胞凋亡的影響Figure 4 The effect of overexpression of MIAT on the apoptosis of GES-1 cells infected by Helicobacter pylori

2.5 炎癥因子水平 感染幽門螺桿菌后，GES-1細胞的IL-1β、IL-6及TNF-α水平均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MIAT后，HP感染的GES-1細胞的IL-1β、IL-6及TNF-α水平均低于未轉(zhuǎn)染MIAT的GES-1細胞和未轉(zhuǎn)染MIAT的HP感染的GES-1細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

有研究[8]報道，MIAT在胃癌組織中存在異常的高表達現(xiàn)象，與患者的不良預(yù)后結(jié)局存在顯著的相關(guān)性，進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)MIAT通過調(diào)控miR-141/DDX5通路，可促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，抵抗放化療作用。MIAT 最早被發(fā)現(xiàn)于2000年，其染色體定位22q12.1，總長度30 051 bp。除胃癌外，已有研究[9-12]報道了MIAT在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中均存在促癌作用。MIAT在乳腺癌、腎癌中均存在顯著的高表達現(xiàn)象，與患者不良預(yù)后結(jié)局高度相關(guān)，顯著縮短患者生存時間[13-14]。另有研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可通過調(diào)控MIAT的表達增強血管平滑肌細胞活力，體外培養(yǎng)的過表達MIAT血管內(nèi)皮細胞可參與TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等。

***P<0.001。圖5 過表達MIAT對GES-1細胞炎癥因子的影響Figure 5 The effect of overexpression of MIAT on inflammatory factors in GES-1 cells

本研究結(jié)果顯示，胃潰瘍組潰瘍組織和血漿的MIAT的表達水平均明顯低于正常組，幽門螺桿菌陽性的胃潰瘍患者的潰瘍組織和血漿中的MIAT表達水平均明顯低于幽門螺桿菌陰性的胃潰瘍患者，提示MIAT低表達參與胃潰瘍的發(fā)生、發(fā)展，且MIAT低表達與幽門螺桿菌的感染存在可能的相關(guān)性[18-20]。本研究結(jié)果同時顯示，幽門螺桿菌感染后GES-1細胞的MIAT表達水平明顯降低。

另外，本研究結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染MIAT的GES-1細胞和未轉(zhuǎn)染MIAT的HP感染的GES-1細胞比較，轉(zhuǎn)染MIAT后，HP感染的GES-1細胞的增殖明顯增加，凋亡率和炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明顯降低，提示胃黏膜細胞MIAT的表達下調(diào)可影響胃黏膜細胞的活性和穩(wěn)定性，導(dǎo)致胃黏膜細胞凋亡和炎癥反應(yīng)；推測通過提高幽門螺桿菌感染的胃黏膜細胞的MIAT表達水平，可增強胃黏膜細胞的活性，維持其穩(wěn)定性，控制炎癥反應(yīng)，實現(xiàn)胃黏膜的保護作用。

綜上，長鏈非編碼RNA MIAT在幽門螺桿菌感染的胃潰瘍中存在低表達現(xiàn)象，MIAT的過表達可促進幽門螺桿菌感染后的胃黏膜上皮細胞增殖，降低凋亡率和炎癥反應(yīng)。