葛小剛　　蔡旗旗　　牟財國　　蔡楊陽

[摘要] 目的 探討堿性成纖維細胞因子（bFGF）對大鼠急性脊髓損傷內質網應激（ERS）信號通路相關蛋白CHOP、Caspase12表達的影響。 方法 選取SD大鼠90只分為三組，每組各30只。Sham組為假手術組;SCI組采用HI-0400脊髓打擊器制備急性脊髓損傷模型;bFGF組在SCI組基礎上予bFGF蛛網膜下隙給藥，評估損傷后不同時點后肢運動功能評分、脊髓細胞凋亡及脊髓組織CHOP、Caspase12表達情況。 結果 bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.533、9.963，P<0.05）。bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）。bFGF組CHOP及Caspase12表達分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。 結論 bFGF可通過抑制ERS相關蛋白CHOP、Caspase12的表達，對大鼠急性脊髓損傷起保護作用。

[關鍵詞] 堿性成纖維細胞因子;內質網應激;大鼠急性脊髓損傷;保護作用;脊髓損傷評分;白細胞介素1-β轉換酶家族12

[中圖分類號] R363? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）11-0036-04

Effect of bFGF on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats

GE Xiaogang CAI Qiqi MOU Caiguo? ?CAI Yangyang

Department of Vascular Surgery， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF） on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to the endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats. Methods A total of 90 SD rats were selected and divided into 3 groups， with 30 rats in each group. The sham group underwent the sham operation. The SCI group underwent the HI-0400 spinal cord percussion device to make acute spinal cord injury models. bFGF was administered to the subarachnoid space in the bFGF group on the basement of the SCI group. The hind legs motor function， spinal cord cell apoptosis and the expression of spinal cord tissue CHOP and Caspase12 at different times after injury were evaluated. Results The BBB scores of the bFGF group were （12.48±0.42） points and （13.53±0.47） points at 21 days and 28 days after injury， which were significantly higher than those in the SCI group， with statistical significance（t=7.533， 9.963; P<0.05）. The cell apoptosis in the bFGF group at 1 day， 3 days， and 7 days after injury was （7.13±0.45）%， （12.42±1.21）%， （10.31±1.27）%， respectively， which were lower than those of the SCI group， the differences were statistically significant（t=4.684， 8.945， 6.507; P<0.05）. The CHOP and Caspase12 expression in the bFGF group were （7.66±0.74） points and （7.52±0.87） points， respectively， which were significantly lower than those in the SCI group， with statistical significance（t=12.348， 8.653; P<0.05）. Conclusion bFGF can protect rats from acute spinal cord injury by inhibiting the expression of ERS-related proteins CHOP and Caspase12.

[Key words] Basic fibroblast growth factor; Endoplasmic reticulum stress; Acute spinal cord injury in rats; Protective effect; Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale; Cystein-asparate protease 12

作為臨床常見的中樞神經系統(tǒng)創(chuàng)傷，脊髓損傷發(fā)病率、致殘率高，且隨著近年來交通及建筑業(yè)的不斷發(fā)展，其發(fā)病率逐年攀升。脊髓損傷主要病理機制為原發(fā)性損傷后的繼發(fā)性損傷，其中脊髓神經元凋亡在脊髓繼發(fā)損傷中有重要作用[1]，且直接影響脊髓神經功能。最新研究結果顯示，內質網應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞凋亡的又一途徑，C/EBP同源性蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）是其特異性轉錄因子[2]。作為新型神經營養(yǎng)因子，堿性成纖維細胞因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）能夠調節(jié)神經細胞生長及分化，通過外源性bFGF給藥能夠對脊髓損傷修復起促進作用[3]。目前，關于bFGF對ERS介導的細胞凋亡研究較少，本研究選擇大鼠90只構建急性脊髓損傷模型，旨在分析bFGF通過ERS信號通路對大鼠急性脊髓損傷的早期保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

90只健康SD雌性大鼠購自上海市公共衛(wèi)生臨床中心[生產許可SCXK（滬）2020-0002]，體重210～240 g，平均（224±15）g;鼠齡6～9周，平均（7.31±0.33）周。bFGF購自北京同立海源生物科技有限公司，兔抗CHOP購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術有限公司，TUNEL試劑盒購自艾美捷科技有限公司。嚴格按照醫(yī)學實驗動物護理及使用指南完成相關操作，本研究經實驗動物管理審批，符合醫(yī)學倫理標準。

1.2 方法

1.2.1 急性脊髓損傷模型制備? 所有大鼠術前12 h禁食，按照40 mg/kg的劑量給予2%戊巴比妥鈉麻醉，將T10棘突作為中心，充分暴露硬脊膜，選擇背部正中位置行一3 cm的切口。制備大鼠急性脊髓損傷模型采用HI-0400脊髓打擊器（北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司），將力度控制在200 kdyn/cm2。置入PE10導管（北京西美杰科技有限公司）至蛛網膜下隙，選擇與脊髓損傷遠端相距1 cm的位置，查看是否存在腦脊液流出，確認有，則采用1-0絲線（義烏市英明線業(yè)有限公司）縫合切口。在切口周圍皮膚處放置導管，固定后進行打擊處理，直至大鼠出現(xiàn)雙下肢及尾部痙攣性抖動。損傷后補液采用生理鹽水。按照200 kU/kg的劑量于大鼠腹腔給予青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，國藥準字H20013036）注射，預防感染。每天對大鼠進行2～3次膀胱按摩。

1.2.2 分組及給藥? 將90只大鼠隨機分為三組，每組各30只，bFGF組予bFGF蛛網膜下隙給藥，SCI組為急性脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）組，Sham組為假手術組。bFGF組損傷后采用IM-9B微量注射器[孚光精儀（中國）有限公司]經導管給予20 μL的bFGF，第1周1次/d，1周后每2周給藥1次。SCI組在相同時點給予生理鹽水注入，注入量同bFGF組。Sham組處理僅打開椎板，不進行脊髓打擊。

1.2.3 脊髓標本采集? 麻醉后，將大鼠放置于灌流池內，取仰臥位，以手術剪剪開大鼠胸腔，穿刺左心室，到達主動脈，予4%多聚甲醛（上海信帆生物科技有限公司）灌注固定，提取3 cm脊髓組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后，切片厚度控制在5 μm。

1.3觀察指標及評價標準

1.3.1 后肢運動功能評分? 后肢運動功能采用大鼠脊髓損傷評分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）評估大鼠損傷后7 d、14 d、21 d及28 d的運動功能，早期后肢關節(jié)活動評分范圍為0～7分，中后期主要評估后肢步態(tài)及協(xié)調功能，分值為8～13分，最后對大鼠爪子的精細活動予以評估，分值范圍為14～21分。后肢運動功能完全正常計為21分[4-5]。

1.3.2 脊髓細胞凋亡? 采用DNA斷裂的原位末端標記[Terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]染色檢測脊髓細胞凋亡，隨機選擇1 d、3 d、7 d各1張脊髓組織切片，按照試劑盒說明進行染色處理，并在Primovert光學顯微鏡（蘇州長南精密技術有限公司）下對結果進行觀察。染色處理后，胞核顯示棕褐色表示陽性細胞，胞核顯示藍色表示非凋亡細胞。

1.3.3 脊髓組織CHOP、Caspase12表達? 采集大鼠脊髓損傷的組織切片進行脫蠟、水化及氧化處理，然后進行抗原修復處理，依次加入兔抗CHOP IgG、抗兔生物素化二抗，分別進行辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）孵育、二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色處理，復染試劑選用蘇木素。隨機抽取5個視野的數(shù)據(jù)，將其平均值作為陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗;不符合正態(tài)分布的計量資料用M（QL，QU）表示，采用秩和檢驗;多組間比較采用F檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組BBB評分比較

三組大鼠在不同時點的BBB評分比較，Sham組評分最高，與SCI組、bFGF組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.533、9.963，P<0.05）。

2.2三組細胞凋亡比較

TUNEL染色結果顯示，損傷后Sham組各時點均無明顯細胞凋亡;損傷后SCI組1 d出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，且凋亡在損傷后3 d最為突出，7 d后逐漸下降。見封三圖2。三組不同時點細胞凋亡比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）;組內不同時點細胞凋亡趨勢與TUNEL染色結果一致。

2.3 三組脊髓組織CHOP、Caspase12表達比較

損傷后7 d，Sham組CHOP、Caspase12表達均低于SCI組及bFGF組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;bFGF組CHOP及Caspase12表達分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。見表3。SCI組CHOP、Caspase12陽性細胞均多于bFGF組，神經元存在脊髓灰質及白質表達，免疫染色顯示棕褐色，細胞核也存在棕褐色。

3 討論

有文獻報道，脊髓損傷后神經功能會受到直接影響，具有較高的致殘率與死亡率，其中細胞凋亡在繼發(fā)性脊髓損傷機制中有重要作用[6]。臨床強調，針對脊髓損傷應盡早選擇合適的藥物，積極抑制繼發(fā)性凋亡，以實現(xiàn)疾病逆轉。作為細胞凋亡的關鍵信號通路，ERS介導的凋亡通路對早期細胞凋亡能產生積極的影響[7]，其可激活未折疊蛋白反應，從而更好地適應各項應激反應，當其過度表達時，則會導致神經細胞凋亡。

作為脊髓損傷后常用的評估運動功能的方法，BBB評分能夠相對準確、客觀地反映后肢運動功能情況。本研究結果顯示，bFGF組損傷后21 d、28 d的BBB評分分別為（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.533、9.963，P<0.05），提示大鼠脊髓損傷后多伴有嚴重的后肢癱瘓，予bFGF干預后，其脊髓損傷后后肢運動功能能夠得到良好的恢復。bFGF組損傷后1 d、3 d、7 d細胞凋亡分別為（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05），提示bFGF可以通過促進局部內環(huán)境穩(wěn)定而抑制細胞凋亡。且bFGF可以擴張血管或促使關閉的微血管開放，從而上調SCI部位血流量，改善其缺血缺氧情況;b FGF可以增強SCI后損傷區(qū)內皮細胞β1整合素表達，使內皮細胞的黏附、識別和遷移加強，從而促進血管形成。bFGF組CHOP及Caspase12表達分別為（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，顯著低于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.348、8.653，P<0.05）。作為轉錄因子家族C/EBP的成員，CHOP是ERS的特異轉錄因子[8-9]，當出現(xiàn)嚴重或持續(xù)性的ERS時，CHOP被激活。正常情況下，CHOP呈低表達，當受到ERS影響時，其呈現(xiàn)增高趨勢，促使細胞凋亡[10]。既往研究結果顯示，bFGF的生物學特性廣泛，在神經細胞增殖、分化及凋亡中均有一定作用，目前被應用于神經損傷修復領域[11-13]，成為醫(yī)學界研究的重點。白細胞介素1-β轉換酶家族12（Cystein-asparate protease 12，Caspase 12）是一種組成性蛋白，位于內質網外膜，未被激活時主要以酶原形式存在，能夠對ERS凋亡產生介導作用[14-16]。在ERS狀態(tài)下，Caspase12會被特定位點裂解激活，從而增加表達，并與細胞凋亡Caspase產生級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。脊髓損傷后早期給予bFGF干預能夠對細胞凋亡產生抑制作用，減輕細胞凋亡的程度。有學者認為，給予bFGF后，ERS途徑被激活，導致神經元功能障礙，促使神經細胞凋亡[17-19]，此時CHOP在ERS凋亡進程中也有一定作用，CHOP表達被抑制，進而阻斷或延緩凋亡的發(fā)生，實現(xiàn)脊髓損傷修復的目的[20]。但由于bFGF在ERS信號通路中對大鼠急性脊髓損傷的早期保護作用較為復雜，且本研究時間有限，未能對其他信號通路對大鼠急性脊髓損傷后的早期保護作用進行分析，存在一定的局限，在后續(xù)研究中應進一步進行試驗驗證，為臨床提供依據(jù)。

綜上所述，bFGF通過ERS信號通路能夠抑制CHOP、Caspase12表達，發(fā)揮對大鼠急性脊髓損傷的早期保護作用，對于脊髓損傷的臨床治療及藥物開發(fā)具有一定的參考價值。

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（收稿日期：2020-11-18）