王月嬌　　史學(xué)森　　白雪峰

[摘要] 目的 探討結(jié)直腸癌中CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性及臨床病理學(xué)意義。 方法 收集2019年1—12月包頭市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌腫物及癌旁5 cm、10 cm石蠟組織標(biāo)本各41例，免疫組化法檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)水平，Sanger測序法檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。 結(jié)果 結(jié)直腸癌癌組織CD4+T細(xì)胞表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)為108.8個(gè)，高于癌旁5 cm的73.8個(gè)及癌旁10 cm的38.0個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;癌組織CD8+T細(xì)胞表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)為63.8個(gè)，高于癌旁5 cm的33.8個(gè)及癌旁10 cm的22.4個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;癌組織PD-L1表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)為18.0個(gè)，高于癌旁5 cm的3.2個(gè)及癌旁10 cm的1.2個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。神經(jīng)侵犯、脈管癌栓與結(jié)直腸癌癌組織CD4+T細(xì)胞表達(dá)相關(guān)，MSI、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓與CD8+T細(xì)胞表達(dá)有關(guān)，MSI、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓與PD-L1的表達(dá)均無關(guān)。PD-L1和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.350，P<0.05），PD-L1與CD4+T細(xì)胞表達(dá)無相關(guān)性（r=0.138，P>0.05）。 結(jié)論 CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1在癌組織高表達(dá)，CD8+T與CD4+T細(xì)胞兩者的高表達(dá)可作為預(yù)后良好的輔助判斷指標(biāo)，PD-L1與CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;CD4+T細(xì)胞;CD8+T細(xì)胞;PD-L1;微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

[中圖分類號] R735.35? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）09-0152-04

The expression and significance of CD4+T， CD8+T cell and PD-L1 in colorectal cancer

WANG Yuejiao1? ?SHI Xuesen2? ?BAI Xuefeng3

1.Graduate School of Baotou Medical College， Baotou? 014040， China; 2.Baotou Center for Disease Control and Prevention in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou? 014030， China; 3.Department of Pathology， Baotou Cancer Hospital in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou? 014030， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD4+T cells， CD8+T cells and PD-L1 in colorectal cancer， and to analyze their correlation and clinicopathological significance. Methods 41 cases of colorectal cancer tumors and paraffin tissue specimens 5 cm and 10 cm adjacent to the cancer were collected from Baotou Cancer Hospital from January to December 2019. The expression levels of CD4+T， CD8+T cells and PD-L1 were detected by immunohistochemistry， and the microsatellite instability was detected by sanger sequencing method. Results The number of CD4+T cells in colorectal cancer tissues was 108.8， which was higher than 73.8 cells in 5 cm adjacent to cancer and 38.0 cells in 10 cm adjacent to cancer， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of CD8+ T cells in cancer tissue was 63.8， which was higher than 33.8 in 5 cm and 22.4 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）; The number of PD-L1 positive cells in cancer tissue was 18.0， which was higher than 3.2 in 5 cm and 1.2 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）. MSI， lymph node metastasis and vascular tumor thrombus were related to the expression of CD8+T cells. MSI， lymph node metastasis， nerve invasion and vascular tumor thrombus were not related to the expression of PD-L1. There was a low positive correlation between the expression of PD-L1 and CD8+T cells（r=0.350， P<0.05）， but no correlation between the expression of PD-L1 and CD4+T cells（r=0.138， P>0.05）. Conclusion CD4+T cells， CD8+T cells， and PD-L1 are highly expressed in cancer tissues. The high expression of CD8+T cells and CD4+T cells can be used as auxiliary indicators for a good prognosis. The expression of PD-L1 is positively related to CD8+T cells.

[Key words] Colorectal cancer; CD4+T cells; CD8+T cells; PD-L1; Microsatellite instability

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第三位[1]。近年來CRC的死亡率明顯上升，因此深入研究并尋找新的治療策略意義重大。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是腫瘤細(xì)胞免疫的重要組分，CD8+T細(xì)胞是主要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞則促進(jìn)其活化增殖，二者協(xié)同可對抗腫瘤。程序性死亡因子-1（Programmmed death-1，PD-1）/程序性死亡因子配體-1（Programmmed death ligand-1，PD-L1）屬負(fù)性刺激分子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。目前PD-L1的抗體阻斷治療已在微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Microsatellite instability，MSI）型CRC中取得較為可觀的療效。但前期研究中PD-L1與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的關(guān)系分析卻少有報(bào)道。本研究旨在檢測CRC癌組織和癌旁組織中CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)水平，并分析其相關(guān)性及意義，為CRC的預(yù)后判斷及免疫治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1—12月包頭市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的CRC腫物及癌旁5 cm、10 cm石蠟組織標(biāo)本各41例，均為首次切除，且無結(jié)直腸免疫相關(guān)病史，術(shù)前亦未行放化療或生物免疫治療。其中男34例，女7例，年齡46～79歲，平均（62.63±8.47）歲;結(jié)腸癌21例，直腸癌20例;脈管癌栓陽性19例，陰性22例;神經(jīng)侵犯陽性17例，陰性24例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性19例，陰性22例;MSI陽性7例，陰性34例。年齡、性別、腫瘤部位、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料從原病歷中獲取。本研究已通過包頭市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.2 試劑

CD4兔單克隆抗體（克隆號SP35）、CD8兔單克隆抗體（克隆號SP16）、PD-L1兔單克隆抗體（克隆號MXR003）、免疫組化S-P法檢測試劑盒、DAB試劑盒均購自福建邁新生物工程有限公司;石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;MSI基因檢測試劑盒購自北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1 以切片的方式處理石蠟包埋組織，獲得4.0 μm厚度的薄片，在載玻片上粘附后，置于65℃環(huán)境下持續(xù)2 h烘烤，再進(jìn)行脫蠟，0.01 M EDTA（pH=9.0）高壓修復(fù)2.5 min，自然冷卻后，滴加0.3%的H2O2 10 min，一抗37℃孵育1 h，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，再經(jīng)分色、返藍(lán)、脫水、透明后封片，讀片觀察結(jié)果。

1.3.2 Sanger法檢測MSI? 將石蠟包埋組織切片置于1.5 mL無菌離心管中，提取基因組DNA，并檢測濃度，然后稀釋后進(jìn)行Sanger法測序，分析結(jié)果。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)? 采用病理切片掃描儀掃描切片，NDP.View2軟件觀察，于低倍視野下選取5個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的區(qū)域，然后將視野放大30倍，計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。當(dāng)細(xì)胞膜被染成棕色時(shí)，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞為陽性，細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)或是兩者之一呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，PD-L1為陽性[3-4]。

1.4.2 判定MSI的標(biāo)準(zhǔn)? 微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生在兩個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記位點(diǎn)上，稱為MSI（+），只發(fā)生在一個(gè)或更少的位點(diǎn)上稱為MSI（-）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，其中PD-L1在癌旁5 cm和10 cm處的表達(dá)數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)數(shù)據(jù)均顯示方差不齊，因此三者表達(dá)及比較均選擇非參數(shù)Kruskal-Wallis法，通過Bonferroni對組間兩兩比較進(jìn)行校正，采用[M（Q1，Q3）]進(jìn)行描述。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。癌組織中三種標(biāo)志物表達(dá)量與病理參數(shù)關(guān)系的分析采用二元Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1在CRC癌組織、癌旁5 cm和10 cm的表達(dá)水平比較

CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1在CRC癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)。CD4+T細(xì)胞在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，在癌旁5 cm的表達(dá)水平高于癌旁10 cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CD8+T細(xì)胞和PD-L1在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其在癌旁5 cm和癌旁10 cm的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 CRC癌組織CD4+、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)與脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MSI的二元Logistic回歸分析

CD4+T細(xì)胞在CRC癌組織中的表達(dá)與脈管癌栓和神經(jīng)侵犯相關(guān)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MSI無關(guān)（P>0.05）。CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MSI相關(guān)（P<0.05），與神經(jīng)侵犯無關(guān)（P>0.05）。PD-L1的表達(dá)與脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MSI均無關(guān)（P>0.05）。

2.3 CRC癌組織內(nèi)CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞兩者和PD-L1表達(dá)間的相關(guān)性分析

通過Pearson分析發(fā)現(xiàn)，CRC癌組織內(nèi)PD-L1與CD8+T細(xì)胞的表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.350，P=0.025），與CD4+T細(xì)胞無相關(guān)性（r=0.138，P=0.390）。

3 討論

TIL在腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。在腫瘤發(fā)生初期，免疫系統(tǒng)可檢測并清除已發(fā)生的腫瘤細(xì)胞，此為免疫清除階段。該階段既可使腫瘤細(xì)胞完全被清除，也可僅清除部分腫瘤細(xì)胞。在部分清除情況下，幸存的腫瘤細(xì)胞變體與宿主免疫系統(tǒng)將進(jìn)入一種動(dòng)態(tài)平衡。在平衡階段，免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞施加一種強(qiáng)有力的選擇性壓力，足以抑制但不能完全殺滅許多遺傳不穩(wěn)定且快速變異的癌細(xì)胞。在此選擇期間，原腫瘤細(xì)胞的很多逃逸變種被破壞，出現(xiàn)新的變種，攜帶不同的突變基因，使它們的抗免疫攻擊能力增強(qiáng)?？傊?，免疫系統(tǒng)未能完全清除腫瘤，卻篩選出能抵抗免疫應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致逃逸階段的出現(xiàn)[5]。在癌癥等慢性炎癥部位T細(xì)胞長期激活會(huì)發(fā)生衰竭，衰竭的T細(xì)胞高水平表達(dá)受體PD-1。PD-L1與PD-1兩者結(jié)合會(huì)在T細(xì)胞受體周圍引起一系列的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，有效防止T細(xì)胞活化，損害了T細(xì)胞的免疫功能，致使腫瘤發(fā)生免疫逃逸[6]。

本研究結(jié)果顯示，CRC癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá)均顯著高于癌旁5 cm及癌旁10 cm。周瑋等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在50例散發(fā)性結(jié)直腸癌中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)率均較相應(yīng)的癌旁組織高，Hua等[8]發(fā)現(xiàn)，PD-L1在正常大腸組織內(nèi)無表達(dá)或低表達(dá)，在CRC癌組織中顯著高表達(dá)，這與本研究結(jié)果類似。由此可見宿主確實(shí)對結(jié)直腸癌產(chǎn)生了免疫應(yīng)答反應(yīng)，使癌組織中的免疫效應(yīng)細(xì)胞聚集增加。但結(jié)直腸癌的進(jìn)展沒有因?yàn)榇罅康牧馨图?xì)胞浸潤而終止，其原因可能是腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)的PD-L1激活了PD-1/PD-L1通路，降低了T淋巴細(xì)胞活性，使癌細(xì)胞未能被完全清除而發(fā)生了逃逸。

目前針對各種T淋巴細(xì)胞亞型的研究發(fā)現(xiàn)，高度浸潤的TIL可作為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。Taichi等[9]和Kuwahara等[10]的研究均證實(shí)CD4+T淋巴細(xì)胞的高表達(dá)與患者的良好預(yù)后相關(guān)，還有大量的研究證據(jù)顯示，CD8+TIL的密度與不同類型癌癥患者的長期生存均相關(guān)[11-12]，但目前國內(nèi)外關(guān)于PD-L1在CRC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性報(bào)道尚無明確共識(shí)。本研究采用Logistic回歸分析的方法得出，CRC癌組織中CD4+T細(xì)胞的浸潤程度越高發(fā)生脈管癌栓和神經(jīng)侵犯的風(fēng)險(xiǎn)越低;CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量越多，發(fā)生脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的概率也越低。脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性均是預(yù)后良好的表現(xiàn)，且已有學(xué)者認(rèn)為MSI狀態(tài)下的CRC預(yù)后相對較好[13-14]，因此本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

T淋巴細(xì)胞不僅可用來評估預(yù)后，還可利用其自身的免疫活性用于腫瘤的免疫治療。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫療法，在惡性黑色素瘤、乳腺腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療方面已取得了一定進(jìn)展[15]。但是由于腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞經(jīng)常被抑制，導(dǎo)致腫瘤組織浸潤T細(xì)胞數(shù)量少、活性低，嚴(yán)重影響治療效果?？筆D-1/PD-L1單克隆抗體可有效抑制PD-1/PD-L1信號傳導(dǎo)通路，其在多種實(shí)體腫瘤中的治療效果已得到證實(shí)[16-18]。諸多研究證明，阻斷PD-1或PD-L1等免疫檢查位點(diǎn)能增加腫瘤部位的T細(xì)胞數(shù)量，提高T細(xì)胞的免疫殺傷功能[19]。因此T細(xì)胞免疫治療與免疫檢查位點(diǎn)阻斷二者相結(jié)合，將有望提升腫瘤治療效果，成為腫瘤治療研究的新觀點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，CRC癌組織中PD-L1與CD8+T細(xì)胞的表達(dá)存在低度正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了Sudoyo等[20]的觀點(diǎn)，認(rèn)為PD-L1在CRC中的表達(dá)主要是由于CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤所致。這將為腫瘤免疫治療策略提供重要的理論依據(jù)。

綜上所述，TIL亞群CD4+T、CD8+T細(xì)胞和PD-L1在CRC癌組織中高度浸潤。TIL有助于機(jī)體對抗腫瘤和提高預(yù)后，而PD-L1有可能影響TIL對腫瘤的殺傷作用，促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。因此，TIL細(xì)胞免疫治療與PD-L1阻斷劑結(jié)合有望開創(chuàng)腫瘤免疫治療的新局面。PD-L1與CD8+T細(xì)胞的正相關(guān)性，也將為其提供理論支持。

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（收稿日期：2020-10-16）