哈爾濱醫(yī)科大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系(150081) 張 薇 孫 琳 王玉鵬 劉美娜

【提 要】 目的 基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法識(shí)別IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)蛋白質(zhì)共表達(dá)模塊及樞紐蛋白，為其發(fā)生機(jī)制研究提供依據(jù)。方法 收集IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受患者及健康對(duì)照血清樣本，使用DIA全掃描蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量技術(shù)獲得蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)；利用WGCNA方法構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)的模塊，并進(jìn)行模塊GO功能注釋及KEGG通路富集分析；利用Cytoscape獲得IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)模塊的樞紐蛋白。結(jié)果 獲得IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)的蛋白質(zhì)模塊兩個(gè)，分別為blue模塊和turquoise模塊。blue模塊與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)系數(shù)為-0.90；GO富集分析發(fā)現(xiàn)，該模塊中蛋白主要參與脂蛋白重構(gòu)、脂質(zhì)代謝等相關(guān)生物過(guò)程以及蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)激活、補(bǔ)體激活等免疫調(diào)節(jié)過(guò)程；KEGG分析富集到5條通路，包括膽固醇代謝通路、PPAR信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、類維生素A代謝和運(yùn)輸通路、維生素和輔酶因子代謝通路。turquoise模塊與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)系數(shù)為0.72；GO富集分析發(fā)現(xiàn)，該模塊主要與蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)激活、補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑、體液免疫應(yīng)答、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，血小板脫顆粒、抗氧化活性等生物過(guò)程有關(guān)；KEGG分析富集到2條通路，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、吞噬體通路。篩選出IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)模塊中的樞紐蛋白為APOA1、APOA4、APOC3、APOA2、APOC1、C3、HRG、FGB、HP、TF。結(jié)論 WGCNA方法進(jìn)行IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：脂質(zhì)、膽固醇代謝等過(guò)程的改變可能是其發(fā)生的重要環(huán)節(jié)；獲得的載脂蛋白類蛋白質(zhì)及其他樞紐蛋白是其潛在關(guān)鍵調(diào)控蛋白；本研究從系統(tǒng)生物學(xué)的角度，為IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生機(jī)制探索提供了依據(jù)和研究方向。

食物不耐受是一種常見(jiàn)的由食品或食品添加劑引起的食物不良反應(yīng)，發(fā)生率為5～20%[1]。其中，IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受在我國(guó)食物不耐受中占較高比例[2-3]，患者多伴有蕁麻疹、腸易激綜合癥、偏頭痛等全身系統(tǒng)性癥狀[4-10]，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)是一種常用的系統(tǒng)性網(wǎng)絡(luò)分析方法，利用WGCNA分析轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，可識(shí)別疾病相關(guān)基因模塊及樞紐基因，發(fā)現(xiàn)疾病診斷、治療等潛在重要靶點(diǎn)[11-13]。近年來(lái)，該方法也被用于分析大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度，研究疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化[14-15]。本研究利用WGCNA方法進(jìn)行系統(tǒng)性分析，從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整體出發(fā)，識(shí)別IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)蛋白質(zhì)模塊，揭示其蛋白變化情況及參與的生物學(xué)過(guò)程，獲得IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)模塊的樞紐蛋白，為其發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

方 法

1.研究對(duì)象

研究對(duì)象來(lái)源于2017年3月至2017年12月在某醫(yī)院過(guò)敏反應(yīng)科就診患者及體檢中心健康人群，收集血清樣本，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行14項(xiàng)食物特異性IgG抗體檢測(cè)：特異性IgG抗體濃度<50U/ml為陰性結(jié)果，≥50U/ml為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)合臨床癥狀、就診患者自述飲食情況及酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)結(jié)果，排除其他食物特異性IgG抗體陽(yáng)性患者，獲得僅為西紅柿特異性IgG抗體陽(yáng)性的患者7例，作為IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受患者組；對(duì)照組按照年齡±2歲、性別相同與病例組進(jìn)行1：2匹配，得到檢測(cè)結(jié)果為陰性且無(wú)食物過(guò)敏史的14例健康人作為對(duì)照組?；颊呒皩?duì)照的年齡、性別、西紅柿特異性IgG抗體濃度信息如表1所示。

表1 IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受患者及健康對(duì)照基本信息

2.蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

本研究采用非數(shù)據(jù)依賴性采集(DIA)技術(shù)進(jìn)行蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)檢測(cè)，將質(zhì)譜的整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，每個(gè)窗口中的所有母離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測(cè)，無(wú)遺漏地獲得樣本中所有母離子的全部碎片信息。

3.WGCNA分析

WGCNA是一種數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法，將表達(dá)模式相似的蛋白質(zhì)聚類于同一模塊，該模塊中的蛋白質(zhì)可能共同參與調(diào)控某個(gè)生物過(guò)程，根據(jù)模塊與性狀之間的相關(guān)性獲得疾病相關(guān)模塊。主要步驟為：

第一，確定最佳軟閾值：蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)符合無(wú)尺度特征，服從冪律分布；將軟閾值取值范圍設(shè)為1～20，以首次出現(xiàn)無(wú)尺度擬合指數(shù)R2接近0.9，且同時(shí)使網(wǎng)絡(luò)平均連接度不至于太低(需顯著大于0)的閾值作為最佳軟閾值，用于拓?fù)渲丿B矩陣(TOM)的計(jì)算。

第二，構(gòu)建蛋白共表達(dá)模塊：計(jì)算蛋白之間的Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣，利用最佳軟閾值計(jì)算TOM和蛋白間相異性系數(shù)，得到蛋白系統(tǒng)聚類樹(shù)；按照每個(gè)模塊中至少包含30個(gè)蛋白的原則，混合動(dòng)態(tài)剪切樹(shù)，初步構(gòu)建蛋白模塊；計(jì)算每個(gè)模塊的特征向量值(ME)，對(duì)模塊進(jìn)行聚類分析，以高度值0.25作為分割線合并相似度較高的模塊，得到最終的蛋白共表達(dá)模塊。

第三，模塊與疾病的關(guān)聯(lián)分析：每個(gè)模塊的第一主成分作為特征向量蛋白，代表該模塊內(nèi)蛋白表達(dá)的整體水平，將模塊特征值與是否患病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定與疾病相關(guān)的蛋白共表達(dá)模塊和模塊內(nèi)蛋白集合。

4.富集分析

在WGCNA分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Metascape對(duì)識(shí)別出的疾病相關(guān)模塊中的蛋白集合進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，獲得包括生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)在內(nèi)的模塊功能注釋信息和KEGG通路，揭示疾病發(fā)生涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

5.樞紐蛋白識(shí)別

WGCNA分析識(shí)別的疾病相關(guān)模塊中的蛋白集合，在Cytoscape軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并借助其中的CytoHubba插件，選擇MCC算法，獲得每個(gè)模塊網(wǎng)絡(luò)中的蛋白重要性排序，篩選模塊中的樞紐蛋白。

結(jié) 果

1.最佳軟閾值選擇

利用DIA蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)技術(shù)，從血清樣本中鑒定并定量出1132個(gè)蛋白質(zhì)，進(jìn)行WGCNA分析。根據(jù)無(wú)尺度擬合指數(shù)R2和平均連接度在軟閾值不同取值時(shí)的變化情況，確定了最佳軟閾值為3，此時(shí)無(wú)尺度擬合指數(shù)R2首次接近0.9，且網(wǎng)絡(luò)的平均連接程度相對(duì)較高，能夠包含足夠的信息。

2.蛋白共表達(dá)模塊構(gòu)建

利用最佳軟閾值3計(jì)算得到的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲丿B矩陣TOM進(jìn)行聚類分析，最終得到14個(gè)蛋白共表達(dá)模塊，如圖1所示。圖中聚類樹(shù)的每個(gè)分支代表一個(gè)蛋白，每個(gè)顏色代表一個(gè)模塊，模塊中的蛋白數(shù)目從32到158不等；每個(gè)模塊內(nèi)的蛋白間共表達(dá)程度高，在功能上具有緊密的關(guān)系；不同模塊間蛋白的共表達(dá)程度低；grey模塊代表未分配到任何模塊中的蛋白集合，包含95個(gè)蛋白。

圖1 IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受的蛋白聚類樹(shù)及蛋白共表達(dá)模塊

3.IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受關(guān)鍵模塊識(shí)別

每個(gè)蛋白共表達(dá)模塊與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如圖2所示。blue模塊與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受的相關(guān)系數(shù)為-0.9，turquoise模塊與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受的相關(guān)系數(shù)為0.72，二者與IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的相關(guān)性較高，可以作為關(guān)鍵模塊進(jìn)行后續(xù)分析。圖3為blue模塊和turquoise模塊中蛋白顯著性與模塊隸屬度的關(guān)系，以及兩個(gè)模塊的蛋白表達(dá)量熱圖與特征值柱狀圖。模塊中蛋白在該模塊內(nèi)的模塊隸屬度，為該蛋白與本模塊特征蛋白的相關(guān)系數(shù)，與性狀高度相關(guān)的蛋白也是與性狀模塊高度相關(guān)的蛋白，值得進(jìn)一步的深入研究。

圖2 蛋白共表達(dá)模塊與性狀相關(guān)性

圖3 (a)blue模塊蛋白顯著性與模塊隸屬度關(guān)系；(b)blue模塊蛋白表達(dá)量熱圖與特征值柱狀圖；(c)turquoise模塊蛋白顯著性與模塊隸屬度關(guān)系；(d)turquoise模塊的蛋白表達(dá)量熱圖與特征值柱狀圖

4.關(guān)鍵模塊的富集分析

blue模塊和turquoise模塊的GO功能注釋結(jié)果分別如圖4(a)和圖4(b)所示。blue模塊中蛋白主要參與血漿脂蛋白顆粒組裝、重構(gòu)，高密度脂蛋白顆粒重構(gòu)，膽固醇酯化調(diào)節(jié)等脂蛋白相關(guān)過(guò)程以及蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)激活，補(bǔ)體激活，體液免疫應(yīng)答等免疫過(guò)程；turquoise模塊中蛋白主要與蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)激活，補(bǔ)體激活經(jīng)典通路，體液免疫應(yīng)答，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，血小板脫顆粒，抗氧化活性等有關(guān)。此外，兩個(gè)模塊的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，blue模塊富集到5條通路，包括膽固醇代謝通路、PPAR信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、類維生素A代謝和運(yùn)輸通路、維生素和輔酶因子代謝通路；turquoise富集到2條KEGG通路，為補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、吞噬體通路。

圖4 blue模塊和turquoise模塊GO富集分析結(jié)果

5.樞紐蛋白識(shí)別

圖5為blue模塊和turquoise模塊的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果，獲得每個(gè)模塊網(wǎng)絡(luò)中的蛋白重要性排序后，在兩個(gè)模塊中各選前5個(gè)蛋白作為樞紐蛋白，包括APOA1、APOA4、APOC3、APOA2、APOC1、C3、HRG、FGB、HP、TF。這些蛋白在模塊中與其他蛋白的關(guān)聯(lián)性較多，發(fā)揮重要的作用，可作為IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的潛在關(guān)鍵調(diào)控蛋白進(jìn)行深入研究。

圖5 blue模塊和turquoise模塊樞紐蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

本研究利用WGCNA分析IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，獲得了疾病相關(guān)的蛋白共表達(dá)模塊，篩選出樞紐蛋白，為揭示IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受潛在的發(fā)病機(jī)制和調(diào)控過(guò)程提供依據(jù)。番茄紅素是西紅柿中富含的主要營(yíng)養(yǎng)素，具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為A類營(yíng)養(yǎng)素，可以調(diào)整腸胃功能，增強(qiáng)免疫力，降低血壓和膽固醇，促進(jìn)脂質(zhì)代謝，抑制胰島素抵抗和代謝紊亂等[16-17]。因此，IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)病機(jī)制及其關(guān)鍵調(diào)控蛋白的研究具有重要意義。

西紅柿中的番茄紅素可以促進(jìn)脂質(zhì)代謝，而脂質(zhì)代謝及相關(guān)產(chǎn)物對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的影響[18]，能夠預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生，促進(jìn)皮膚和淋巴結(jié)炎性反應(yīng)。WGCNA分析識(shí)別IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)模塊的GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，模塊中蛋白主要富集于血漿脂蛋白顆粒組裝、高密度脂蛋白顆粒重構(gòu)、膽固醇酯化調(diào)節(jié)、抗氧化活性、補(bǔ)體激活、體液免疫應(yīng)答等生物過(guò)程；關(guān)鍵模塊蛋白的KEGG通路分析也富集到了膽固醇代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等通路，揭示了脂質(zhì)、膽固醇代謝等過(guò)程的改變，引起免疫系統(tǒng)功能變化，可能是IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。此外，本研究識(shí)別出的IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受相關(guān)模塊樞紐蛋白APOA1、APOA4、APOC3、APOA2、APOC1，均為載脂蛋白類蛋白質(zhì)，參與脂質(zhì)代謝過(guò)程，且與免疫功能有關(guān)，提示我們載脂蛋白可能在IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生中起到了關(guān)鍵作用，是參與其發(fā)病機(jī)制調(diào)控的重要蛋白，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，收集更多的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究利用WGCNA分析IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，富集到多個(gè)有意義的生物學(xué)過(guò)程和通路。其中，脂質(zhì)、膽固醇代謝等過(guò)程的改變可能是IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的重要環(huán)節(jié)；獲得的載脂蛋白類蛋白質(zhì)是IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生的潛在關(guān)鍵調(diào)控蛋白，為IgG介導(dǎo)的西紅柿不耐受發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的探索研究提供了參考和依據(jù)。