陳剛 唐海濤 王玉春 王凱 張磊 王晶 曹艷菲

膠質(zhì)瘤作為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中占比較高的一類疾病，與本病相關(guān)的眾多研究中，關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究多見。lnc RNA是近年來在較多疾病患者中研究較多的方面，其對(duì)于細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞分化調(diào)控等方面發(fā)揮著重大作用，其表達(dá)或功能方面的異常與較多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而各類lnc RNA在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)研究不斷增多[1-2]，XIST作為lnc RNA中研究較多的一類，其在膠質(zhì)瘤中的細(xì)致變化研究[3]，包括對(duì)生物學(xué)功能的影響研究不足，故認(rèn)為其仍有待深入探究，以為膠質(zhì)瘤的診治提供參考依據(jù)。本研究就lnc RNA XIST在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能進(jìn)行研究與探討，現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)分析并報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）選取2018年6月—2019年5月的35例膠質(zhì)瘤患者為觀察組，同時(shí)期的35例腦外傷患者為對(duì)照組。對(duì)照組中包括男性22例，女性13例，年齡為21～63歲，平均年齡（39.0±6.6）歲；致傷原因：車禍致傷者26例，其他9例。觀察組中包括男性23例，女性12例，年齡為22～63歲，平均年齡（39.2±6.9）歲；分級(jí)：Ⅰ級(jí)者8例，Ⅱ級(jí)者10例，Ⅲ級(jí)者9例，Ⅳ級(jí)者8例。兩組的年齡與性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）中科院細(xì)胞庫膠質(zhì)瘤U87及U251細(xì)胞。

1.2 方法

采集觀察組的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及對(duì)照組的健康腦組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，采用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行組織lnc RNA XIST表達(dá)情況的檢測(cè)；進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑的配置，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87及U251進(jìn)行轉(zhuǎn)染，術(shù)前1 d接種于6孔板，首先以10%血清培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞配合度在70%～80%時(shí)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，形成siRNA XIST，并設(shè)置siRNA-NC；于轉(zhuǎn)染完成后48 h進(jìn)行克隆數(shù)方面的檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)，主要為以克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，以5 000個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，直至克隆集落形成后進(jìn)行下一步的固定染色處理，進(jìn)行U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)；然后采用AnnexinV/PI雙染色細(xì)胞凋亡試驗(yàn)進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，在細(xì)胞融合度在80%時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基清洗，依次進(jìn)行其他處理，并以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，判定各個(gè)象限的細(xì)胞情況，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞比率；對(duì)U87及U251進(jìn)行Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，培養(yǎng)后，基底膜干燥后采用單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，并于顯微鏡下進(jìn)行5個(gè)視野細(xì)胞穿膜數(shù)的統(tǒng)計(jì)。然后統(tǒng)計(jì)及比較兩組、觀察組中不同分級(jí)者的組織lnc RNA XIST表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)、凋亡細(xì)胞比率及細(xì)胞穿膜數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

研究中的數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 23.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）表達(dá)，進(jìn)行t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料進(jìn)行方差分析，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組、觀察組中不同分級(jí)者的組織lnc RNA XIST表達(dá)情況比較

觀察組的lnc RNA XIST表達(dá)高于對(duì)照組，觀察組中不同分級(jí)者的組織lnc RNA XIST表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)比較

轉(zhuǎn)染siRNA XIST的U87及U251 XIST表達(dá)量下調(diào)為80%；轉(zhuǎn)染siRNA AGAP2-AS1的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)低于siRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251凋亡細(xì)胞比率比較

轉(zhuǎn)染siRNA AGAP2-AS1的U87及U251凋亡細(xì)胞比率高于siRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞穿膜數(shù)比較

轉(zhuǎn)染siRNA AGAP2-AS1的U87及U251細(xì)胞穿膜數(shù)低于siRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

近年來關(guān)于各類長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究不斷增多，研究普遍顯示，其在各類腫瘤的生殖、侵襲等功能中具有重要的調(diào)控作用[4-5]。而lnc RNA XIST作為一類重要長(zhǎng)鏈非編碼RNA，有研究認(rèn)為其是miR-429、miR-204-5p的靶向miRNA，而miR-429及miR-204-5p對(duì)于膠質(zhì)瘤的增殖、遷徙及侵襲等生物學(xué)行為有調(diào)控作用[6-8]。臨床中關(guān)于lnc RNA XIST在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)變化研究可見的同時(shí)，其對(duì)于膠質(zhì)瘤分期的檢測(cè)作用仍有待深入研究[9-10]，而其對(duì)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及凋亡等方面的針對(duì)性影響研究極為匱乏，因此進(jìn)一步細(xì)致探究lnc RNA XIST對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的調(diào)控作用意義較高。

本研究就lnc RNA XIST在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能進(jìn)行探究，結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤病灶組織的lnc RNA XIST表達(dá)升高，且分級(jí)較高者的膠質(zhì)瘤組織lnc RNA XIST表達(dá)相對(duì)更高，同時(shí)siRNA XIST的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)及細(xì)胞穿膜數(shù)低于siRNANC，凋亡細(xì)胞比率高于siRNA-NC，因此認(rèn)為lnc RNA XIST在膠質(zhì)瘤中的檢測(cè)價(jià)值較高，其對(duì)于膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為具有較強(qiáng)的調(diào)控作用。分析原因，可能與lnc RNA XIST通過調(diào)控miR-429及miR-204-5p等miRNA來實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管形成、細(xì)胞增殖及侵襲等影響[11]，且分級(jí)越高者的表達(dá)越高，與疾病的進(jìn)展情況有關(guān)[12]。綜上所述，我們認(rèn)為lnc RNA XIST在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平較高，lnc RNA XIST的高表達(dá)狀態(tài)提升了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力。

表1 兩組、觀察組中不同分級(jí)者的組織lnc RNA XIST表達(dá)情況比較 （）

表1 兩組、觀察組中不同分級(jí)者的組織lnc RNA XIST表達(dá)情況比較 （）

組別lnc RNA XIST觀察組 Ⅰ級(jí)（n=8） 1.03±0.15Ⅱ級(jí)（n=10） 1.86±0.21Ⅲ級(jí)（n=9） 2.29±0.28Ⅳ級(jí)（n=8） 2.81±0.37 F值 70.585 P值 0.000整組（n=35） 2.10±0.26對(duì)照組（n=35） - 0.95±0.12 t值 - 23.758 P值 - 0.000

表2 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)比較 （）

表2 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞克隆數(shù)比較 （）

分類 U87 U251 siRNA XIST 86.32±15.33 88.63±17.65 siRNA-NC 198.68±22.31 210.35±25.35 t值 24.557 23.312 P值 0.000 0.000

表3 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251凋亡細(xì)胞比率比較 （）

表3 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251凋亡細(xì)胞比率比較 （）

分類 U87 U251 siRNA XIST 25.25±2.68 29.89±2.72 siRNA-NC 12.23±1.37 9.96±1.63 t值 25.592 37.183 P值 0.000 0.000

表4 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞穿膜數(shù)比較 （）

表4 siRNA XIST與siRNA-NC的U87及U251細(xì)胞穿膜數(shù)比較 （）

分類 U87 U251 siRNA XIST 16.65±2.21 19.96±2.53 siRNA-NC 58.83±3.39 66.76±3.90 t值 61.664 59.558 P值 0.000 0.000