徐勇鋒, 黃旭東, 陳楚兵, 黃燕青, 黃春明, 洪欽明

1揭陽市中醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東揭陽 522000)； 2揭陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東揭陽 522095)； 3揭陽市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心檢驗(yàn)科(廣東揭陽 522031)； 4揭陽市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東揭陽 522071)； 5揭陽市揭東區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東揭陽 515500)； 6揭陽市榕城區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心檢驗(yàn)科(廣東揭陽 522000)

無乳鏈球菌(streptococcus agalactiae)又稱為B群鏈球菌(group B streptococcus, GBS),妊娠晚期生殖道中無乳鏈球菌的定植，是引起產(chǎn)后宮內(nèi)感染和新生兒肺炎、腦膜炎以及菌血癥的重要原因[1]。研究表明[2]，定植無乳鏈球菌的序列型(sequence type, ST)和血清型分布、耐藥性以及毒力等流行特征均存在地理區(qū)域性差異。近年來，關(guān)于揭陽地區(qū)的定植無乳鏈球菌的分子流性特征鮮有報道。本研究擬對揭陽地區(qū)6家醫(yī)院分離的定植無乳鏈球菌，進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence type, MLST)、分子血清學(xué)分型、耐藥性等流行特征調(diào)查，為該地區(qū)定植無鏈球菌引起的妊娠不良結(jié)局的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本及菌株 本研究共收集妊娠35～37周婦女的陰道直腸拭子1 076份，來源于2018年1月至2019年12月間就診于揭陽市中醫(yī)院、揭陽市人民醫(yī)院、揭陽市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心、揭陽市第三人民醫(yī)院、揭陽市揭東區(qū)人民醫(yī)院和揭陽市榕城區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心等6家醫(yī)院的非重復(fù)患者。標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌ATCC49619、無乳鏈球菌ATCC12403和A909均購自美國典型菌種保藏中心。

1.1.2 試劑和儀器 LIM肉湯、M-H血瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板(廣州迪景公司)、藥敏紙片(英國Oxiod公司)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和Premix Taq(大連TaKaRa公司)。VITEK 2全自動細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀及相關(guān)檢測試劑(法國梅里埃公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、核酸凝膠電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。MLST和所有基因檢測的引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理及菌株鑒定 將收集的陰道直腸拭子放入LIM肉湯，在37℃、5% CO2條件下，孵育24 h。將肉湯轉(zhuǎn)種于血平板上，在37℃、5% CO2條件下，孵育18 h，挑取菌落形態(tài)疑似無乳鏈球菌的菌落進(jìn)行鑒定。同時滿足以下條件者可鑒定為無乳鏈球菌：(1)菌落有β溶血環(huán)；(2)涂片革蘭染色為革蘭陽性球菌，呈鏈狀排列；(3)CAMP實(shí)驗(yàn)呈陽性；(4)經(jīng)VITEK2細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果為無乳鏈球菌。

1.2.2 DNA提取 參照TaKaRa試劑說明的要求和操作步驟，提取細(xì)菌基因組DNA，置于-80℃待用。

1.2.3 MLST分型 采用PCR技術(shù)，參照J(rèn)ones 等[3]的報道，擴(kuò)增7個管家基因(adhP,pheS,atr,glnA,sdhA,glcK和tkt)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測序分析。所獲得的序列經(jīng)MEGA6軟件剪齊后，上傳至pubmlst在線數(shù)據(jù)庫，通過7個管家基因的等基因數(shù)得出各菌株的ST。用eBURST version 3.1軟件對所有ST進(jìn)行克隆群(clonal complexes，CCs)分析。將各類型ST的7個管家基因進(jìn)行拼接后，采用MEGA6軟件用UPGMA法進(jìn)行菌類分析。

1.2.4 分子血清分型 采用多重PCR技術(shù)，參照Imperi等[4]的報道，擴(kuò)增莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)合成基因，通過瓊脂糖凝膠電泳確定各實(shí)驗(yàn)菌株的血清型。分子血清分型以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12403(血清學(xué) Ⅲ型)和A909(血清學(xué)Ⅰa型)參考菌株。

1.2.5 抗菌藥物敏感試驗(yàn) 采用K-B法，檢測各菌株對青霉素(10 units)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、氯霉素(30 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、萬古霉素(30 μg)和四環(huán)素(30 μg)的敏感性。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌藥物敏感試驗(yàn)指南(http://www.clsi.org)2020版的試驗(yàn)要求和藥敏標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株采用標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.2.6 D-抑菌圈試驗(yàn) 參照李東等[5]的報道，對紅霉素耐藥且克林霉素敏感或中介的實(shí)驗(yàn)菌株檢測是否有紅霉素耐藥菌株誘導(dǎo)克林霉素耐藥。D-抑菌圈試驗(yàn)陽性菌株，克林霉素修正為耐藥。根據(jù)D-抑菌圈試驗(yàn)的結(jié)果，對紅霉素和克林霉素耐藥表型進(jìn)行分型。

1.2.7 耐藥基因檢測 參照何其勵等[6]的報道，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增所有試驗(yàn)菌株的紅霉素(ermA、ermB和mefA/E基因)和克林霉素(linB基因)耐藥基因，通過擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果確定耐藥株是否攜帶相應(yīng)的耐藥基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 藥敏結(jié)果采用WHONET5.6軟件進(jìn)行分析。用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果 本研究從6家醫(yī)院1 076份非重復(fù)標(biāo)本中，共檢出103株無乳鏈球菌，該地區(qū)妊娠婦女無乳鏈球菌攜帶率為9.6%(103/1 076)。

2.2 MLST結(jié)果 如圖1所示，本研究共從103株定植無乳鏈球菌種檢出21個ST,其主要ST包括ST19(32.0%)、ST17(18.4%)、ST103(6.8%)和ST23(6.8%)，其他ST所占比例均<5.0%。21個ST來源于8個CC，主要的CC包括CC19(39.8%)、CC17(18.4%)、CC103(16.6%)和CC23(8.8%)。

注：ST，序列型；CC,克隆群；該圖采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析

2.3 分子血清型結(jié)果 本次共檢出5種血清型，分別為Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，所占比例依次為：24.3%(25/103)、12.6%(13/103)、5.8%(6/103)、49.5%(51/103)和7.8%(8/103)。如圖1所示，Ⅲ型主要分布于ST19(43.1%)和ST17(37.3%)、Ⅴ型主要分布于ST19(87.5%)、Ⅱ型主要分布于ST23(66.7%)；而Ia和Ib存在于多種ST中。

2.4 抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 103株試驗(yàn)菌株對青霉素和萬古霉素均敏感(敏感率為100.0%)，對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥率以及多重耐藥率均>60.0%(表1)。本次未發(fā)現(xiàn)對紅霉素、克林霉素和氯霉素中介耐藥的菌株。不同血清型菌株對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率以及多重耐藥率均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1 不同血清型無乳鏈球菌間的耐藥率比較 株(%)

2.5 紅霉素和克林霉素耐藥基因檢測結(jié)果 本研究中的103株試驗(yàn)菌株中，對紅霉素耐藥的74株菌株均檢出耐藥基因，ermA、ermB和mefA/E分別占16.2%(12/74)、83.8%(62/74)和25.7%(19/74)；對克林霉素耐藥的62株菌株中l(wèi)inB基因檢出率為54.8%(34/62)；此外，有3株對紅霉和克林霉素均敏感的試驗(yàn)菌株檢出mefA/E基因。見表2。

表2 103株無乳鏈球菌耐藥表型、基因型與ST相關(guān)關(guān)系

2.6 紅霉素耐藥表型、基因型與ST的相關(guān)性 如表2所示，103株無乳鏈球菌分為5種表型，部分ST的表型和基因型較為集中，如ST17均為cMLSB型且基因型相同、ST103和ST651均為S型基因型也同；但部分ST的基因型和表型較為多樣，如ST19菌株。對紅霉素耐藥的74株菌株，cMLSB、iMLSB和M型等3種耐藥表型分別占73.0%(54/74)、8.1%(6/74)和18.9%(14/74)。

3 討論

無乳鏈球菌定植是引起妊娠不良結(jié)局的重要危險因素[7]。一項(xiàng)納入390篇文獻(xiàn)，涵蓋85個國家、299 924名孕婦的薈萃研究[8]表明，非亞洲地區(qū)、南亞地區(qū)和東亞地區(qū)的無乳鏈球菌定植率分別為：18%(95%CI:17%～19%)、12.5%(95%CI:10%～15%)和11%(95%CI:10%～12%)。雖然本研究中妊娠婦女無乳鏈球菌的定植率(9.6%)和其他東亞地區(qū)相近，但據(jù)報道[2, 9]不同地區(qū)的定植無乳鏈球菌的表型和基因型特征均存在差異，又考慮到我國地域廣闊和龐大的人口基數(shù)，因此深入了解揭陽地區(qū)定植菌株的遺傳多樣性和耐藥性等菌群結(jié)構(gòu)特征，對該地區(qū)的無乳鏈球菌引起感染的防控仍至關(guān)重要。

MLST是細(xì)菌分型研究常用的方法，可快速揭示菌群的譜系分布特征[10]。MLST結(jié)果顯示，本地區(qū)的定植無乳鏈球菌來源于8個CCs，但卻可分為21個ST，這表明揭陽地區(qū)流行的定植菌株有較高的遺傳多樣性。本地區(qū)流行的CC主要是CC19、CC17和CC103(共占74.8%)，這不同其他國家的報道，如:加拿大主要流行的CC為CC1、CC23和CC19[11],埃塞俄比亞主要為CC8、CC2和CC23[12]，這說明主要CC的分布存在地理區(qū)域性差異。CC19(主要為ST19)在國內(nèi)其他地區(qū)也是主要流行的CC[2, 13-14]；而CC17作為國內(nèi)引起新生兒侵襲性感染中重要的CC主要南方地區(qū)流行[14-15]，這和本研究的結(jié)果相一致。國外報道的CC103菌株主要引起牛乳房炎而人類感染較為少見[16]。然而本研究中CC103(占16.6%)為主要的流行CC之一，其所占比例及主要ST組成與其他華南地區(qū)相一致，如：南寧[17]、廣州[2]和深圳[14]。我們據(jù)此推測CC103已成為華南地區(qū)流行的主要定植無乳鏈球菌之一，且其主要ST構(gòu)成相似。但鑒于以上研究多為單中心、小樣本的研究，因此以上推測仍需要更多的流行病學(xué)數(shù)據(jù)支持。

無乳鏈球菌表面的莢膜多糖是其重要的毒力因子，也是血清學(xué)分型的重要依據(jù)[10]。因此，了解無乳鏈球菌的血清型，對了解其致病性至關(guān)重要。無乳鏈球菌血清型有10種，其中世界各地流行的定植菌株多為Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等6種血清型(占98.0%以上)[8]。本研究共發(fā)現(xiàn)5種血清型(Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)，這表明本地區(qū)流行的定植菌株的血清型和世界各地相似。Ⅲ、Ia和Ib等3種類型(占86.4%)為本地區(qū)流行主要血清型，這和廣州[2](93.0%)、東莞[18](85.7%)等地相似，但不同于其他地區(qū)，如：上海和多倫多均以Ⅲ、Ⅴ和Ia為主[11, 19]，而巴西[20]則以Ia、Ⅱ和Ib為主。此外，本研究表明，大部分ST與特定的血清型相對應(yīng)，如：所有ST17均為Ⅲ型；所有ST103均為Ia；但部分ST的血清型分布存在多樣性，如ST19菌株，這也表明了其遺傳的多樣性。值得注意的是，ST17/血清學(xué)Ⅲ型被認(rèn)為是高毒力菌株[15]，可引起威脅生命的新生兒侵襲性感染，而本研究中ST17/血清學(xué)Ⅲ型高達(dá)18.4%(19/103)。

目前，對于定植無乳鏈球菌引起產(chǎn)后感染的防控，美國CDC指南[21]推薦采用青霉素作為首選藥物進(jìn)行分娩前的抗生素預(yù)防。本研究中，所有定植菌株對青霉素均敏感，可作為防御性治療的首選藥物。對于青霉素過敏者，紅霉素和克林霉素是其作為分娩前抗生素預(yù)防的中藥替代藥物。然而，本研究中，定植菌株對紅霉素和克林霉素的耐藥率高(均>60.0%)，因此，若以紅霉素或克林霉素作替代藥物，需結(jié)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行選擇用藥而不適用于經(jīng)驗(yàn)性用藥。定植無乳鏈球菌對紅霉素和克林霉素的高耐藥率，與北京[5]、廣州[2]和福州[22]等國內(nèi)其他地區(qū)報道一致。此外，本地區(qū)定植菌株對四環(huán)素的耐藥率高達(dá)94.2%，在國內(nèi)其他地區(qū)[23]同樣存在。值得注意的是，本地區(qū)定植無乳鏈球菌的多重耐藥率較高。本研究對不同血清型的耐藥率進(jìn)行比較，表明不同血清型對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率以及多重耐藥率均存在差異(P均<0.05)。本研究中，對紅霉素耐藥的定植菌株主要是由ermB基因介導(dǎo)的cMLSB型，這與北京[5]和上海[19]地區(qū)的報道相似；但本地區(qū)的M型(占18.9%)高于北京地區(qū)(占5.2%)。據(jù)報道[24]，法國馬塞地區(qū)以M型為主，而巴黎地區(qū)以iMLSB型為主。這些研究均表明，不同地區(qū)的紅霉素耐藥表型存在差異。而紅霉素耐藥不僅存在表型的差異，其基因型也有一定差異，如國外學(xué)者認(rèn)為M型主要由mefA/E基因介導(dǎo)[24-25]，而在我國存在ermB基因獨(dú)立介導(dǎo)M型的報道[5, 19]，本研究和國內(nèi)的報道一致。此外，本研究有3株S型菌株檢出mefA/E基因，這可能mefA/E基因不表達(dá)有關(guān)。紅霉素耐藥表型、基因型與ST相關(guān)研究表明，部分ST各菌株的耐藥表型和基因型較為一致，但部分ST的耐藥表型和基因型卻表現(xiàn)出多樣性。本研究中，克林霉素耐藥株linB基因檢出率僅為54.8%，這說明定植菌株對克林霉素耐藥可能還與其他耐藥機(jī)制有關(guān)。

總之，揭陽地區(qū)的定植無乳鏈球菌存在較高的遺傳多樣性，總體上其分子流行特征和耐藥特點(diǎn)與其他地區(qū)相似，但也有其自身的特點(diǎn)：(1)CC103已成為該地區(qū)流行的主要CC之一；(2)ST17/血清學(xué)Ⅲ型為該地區(qū)流行的主要定植菌株之一；(3)該地區(qū)定植菌株對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率以及多重耐藥率較高；(4)紅霉素耐藥以ermB基因介導(dǎo)的cMLSB型，克林霉素耐藥部分由linB基因介導(dǎo)。