趙理平, 陳興, 胡玲玲, 鄧玉華, 李漫江, 李建威, 張永良

珠海市婦幼保健院檢驗科(廣東珠海 519001)

t(8;21)(q22;q22)是急性髓系白血病(AML)常見的染色體易位，該易位可產(chǎn)生特異AML1/ETO融合基因，見于12%～20%的AML，尤其在M2型中，其發(fā)生率可高達40%～80%[1]。在t(8;21)(q22;q22)伴額外染色體異常中，以性染色體丟失最多見，但同時伴del(9)(q22)較少見。我們在門診血常規(guī)檢測中發(fā)現(xiàn)1例患兒，僅因單核細胞比例稍增高進行了血涂片形態(tài)學分析，發(fā)現(xiàn)了含Auer小體的幼稚粒細胞，疑是急性髓系白血病早期，遂建議其立即住院確診，經(jīng)骨髓細胞MICM分型診斷為45,X,-X,t(8;21)(q22;q22),del(9)(q22) M2型急性髓系白血病。在兒童急性白血病早期診斷中，血常規(guī)結(jié)合外周血涂片形態(tài)學檢查具有重要的臨床價值?，F(xiàn)將本案例報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患兒，女，7歲， 因發(fā)燒咳嗽于2019年6月13號來我院兒科門診就診，體格檢查無皮疹、無發(fā)紺，無淋巴結(jié)腫大，腹部未捫及包塊，肝脾肋下未及，體溫38.5℃，精神可，食納好，大小便正常。血常規(guī)復查2次，因單核細胞比例增高，其絕對值曾達到復檢規(guī)則，血紅蛋白和血小板計數(shù)偏低行血涂片檢查。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 Beckman Coulter Ac.T 5diff、Beckman Coulter Ac.T 5diff AL血細胞五分類分析儀及配套試劑和質(zhì)控品(美國Beckman-Coulter公司)；CX-31型普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；細胞化學染色試劑購自珠海貝索生物科技有限公司；Beckman Coulter FC500流式細胞儀及配套試劑(美國Beckman-Coulter公司)；0.068M KCL低滲液，Carnoy′s固定液，蛋白酶K消化母液；VYSIS雜交儀，Vysis探針試劑盒(美國Vysis公司)，熒光顯微鏡。

1.2.2 樣本采集 采集EDTA抗凝外周血2 mL檢測血常規(guī)及血涂片；抽取骨髓經(jīng)涂片染色進行細胞形態(tài)學診斷；采集肝素抗凝骨髓液2～3 mL檢測免疫表型；采集肝素抗凝骨髓液5 mL進行培養(yǎng)分析染色體核型；采集肝素抗凝骨髓液2～3 mL進行融合基因檢測。所有標本均采集于治療前。

1.2.3 血常規(guī)檢測 采用Beckman Coulter Ac.T 5diff、Beckman Coulter Ac.T 5diff AL血細胞五分類分析儀分別對患者同一時間2次標本進行檢測。

1.2.4 外周血細胞形態(tài)分析 外周血涂片經(jīng)瑞-吉染色后進行顯微鏡檢查，細胞形態(tài)學特征分析包括細胞形狀、核染色質(zhì)、核仁、胞漿顆粒及胞漿其他內(nèi)容物觀察。

1.2.5 骨髓細胞形態(tài)分析 骨髓涂片經(jīng)瑞-吉染色、過氧化物酶(POX)、酯酶雙染色后進行顯微鏡檢查，細胞形態(tài)學特征分析同上。

1.2.6 免疫分型 采用Beckman Coulter FC500流式細胞儀及配套試劑對標本進行標記和檢測，實驗步驟嚴格按照操作說明書進行，以細胞表面抗原陽性率>20%，CD34>10%為陽性標準。

1.2.7 染色體核型分析 采用未刺激/24 h短期培養(yǎng)法、按照染色體制備標準操作規(guī)程收獲，低滲，固定，滴片，烤片，G顯帶后檢測20個中期細胞進行染色體分析，核型描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》2005年標準。

1.2.8 融合基因檢測 采用VYSIS雜交儀及配套試劑對制備的標本玻片按設(shè)定的程序進行雜交、洗片，自然干燥5 min后，熒光顯微鏡觀測雜交信號。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)結(jié)果 第1次血常規(guī)白細胞計數(shù)(WBC)10.9×109·L-1、單核細胞比例(Mon%) 29.8%、單核細胞絕對值(Mon#)3.3×109·L-1、血紅蛋白(Hb)111 g/L、血小板計數(shù)(PLT)90×109·L-1；第2次復查血常規(guī)WBC 10.6×109·L-1、Mon% 24.9%、Mon# 2.6×109·L-1、Hb 110g/L、PLT 96×109·L-1，第1次Mon#觸犯復檢規(guī)則，見表1。

2.2 外周血細胞形態(tài)分析 外周血涂片瑞-吉染色后經(jīng)顯微鏡觀察，可見含Auer小體的幼稚粒細胞(圖1)，其胞體大，胞漿內(nèi)可見嗜天青顆粒，核染色質(zhì)較細致，核漿比大，偶見核仁1～2個，此類細胞約占外周血白細胞8%左右。

表1 兩次血常規(guī)主要指標結(jié)果

注：箭頭所指為Auer小體

2.3 骨髓細胞形態(tài)學檢查 骨髓涂片經(jīng)瑞-吉染色、POX、酯酶雙染色后進行顯微鏡檢查，結(jié)果顯示粒系增生明顯活躍，原始加早幼粒細胞占53.50%，原始粒細胞胞體大小不一，胞漿少，藍染，可見Auer小體，核大，核染色質(zhì)疏松細致，可見核仁5～6個，中幼粒細胞以下階段比值均偏低，形態(tài)大致正常。POX陽性，酯酶染色AS-DNCE陽性，α-NBE陰性(圖2-A、B)。

注：A：瑞-吉染色，箭頭所指為Auer小體;B：粒系增生明顯活躍;C:可見原始/早幼粒細胞明顯增多;D:POX陽性;E:AS-DNCE陽性

2.4 免疫分型結(jié)果 骨髓中可見43.67%原始/幼稚細胞(R1，紅色)，表達CD34、CD33、CD13、HLA-DR、CD19、CD117、CD15、CD64、CD56、CD38、CD123、MPO，不表達CD7、CD10、CD41、cCD3、cCD79α。符合急性髓系白血病，伴成熟型(FAB:AML-M2)免疫表型(圖3)。

圖3 流式免疫表型檢測結(jié)果

2.5 染色體結(jié)果 標本經(jīng)24 h短期培養(yǎng)，G顯帶分析核型，結(jié)果為45,X,-X,t(8;21)(q22;q22),del(9)(q22)，見圖4。

2.6 融合基因結(jié)果 FISH技術(shù)檢測兒童白血病常見融合基因，可見AML1/ETO基因融合陽性細胞，見圖5。

3 討論

Beckman Coulter Ac.T 5diff血細胞五分類分析儀采用庫爾特原理、細胞化學光吸收和體積分析技術(shù)(AcV)進行細胞計數(shù)及分類，使血常規(guī)檢測具有方便、快捷、高效等特點，然而這類儀器在鑒別血細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)等方面還不夠完善[2]，在遇到疑問時需人工鏡檢予以確認。據(jù)文獻[3]報道，用五分類血液分析儀查血常規(guī)，單核細胞有時與大淋巴細胞會出現(xiàn)失誤，因此在遇到單核細胞分類異常時，最好進行涂片鏡檢。Auer小體是由異常的初級顆粒融合而成，呈紅色棒狀或針狀物質(zhì)，Auer小體的出現(xiàn)標志其所存在的細胞起源于白血病克隆，是AML的形態(tài)學特異性診斷標志之一[4]。

圖4 染色體核型分析結(jié)果

注：箭頭所指為AML1/ETO融合基因

本案例初診時血常規(guī)WBC、Mon%、Mon# 稍增高，Hb、PLT略低，為排除標本及儀器的干擾，重新采血在另一臺儀器上檢測，結(jié)果相近。因第1次Mon#為3.3×109·L-1，觸犯本室復檢規(guī)則(<12歲者Mon#>3.0×109·L-1)，且2次血常規(guī)Hb、PLT偏低，盡管不是明顯降低，未達到復檢要求，包括2次WBC指標也未達到復檢要求，亦即行涂片鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血常規(guī)增多的單核細胞中部分為幼稚粒細胞，而非真正的單核細胞，分析原因可能因幼稚粒細胞體積及胞漿顆粒性質(zhì)均與單核細胞相近，儀器計數(shù)時會將幼稚粒細胞誤入單核細胞導致其假性增高。筆者進一步觀察到此類細胞的胞漿中含有Auer小體，疑是急性髓系白血病早期，遂建議患兒立即住院確診，經(jīng)骨髓細胞MICM診斷為45,X,-X,t(8;21)(q22;q22)，del(9)(q22)M2型急性髓系白血病?？梢娫趦和毙园籽≡缙谠\斷中，血常規(guī)結(jié)合外周血涂片形態(tài)學檢查具有重要的臨床價值，尤其是在白血病隱匿型早期，觀察血常規(guī)各項指標細微變化從而進行涂片檢查尤為重要。門診有時標本量大任務重，檢驗人員未能及時進行血涂片復查鏡檢，隨之而來的問題是導致異常細胞漏檢的情況時常發(fā)生[5]，而白血病的及早發(fā)現(xiàn)對于后期及時干預、挽救患者生命至關(guān)重要。這起案例告誡我們不能放過血常規(guī)指標的任何變化,必要時必須人工鏡檢予以確認以防漏診。

t(8;21)(q22;q22)染色體易位由Rowley等于1973年首次鑒定。伴有t(8;21)(q22;q22)的AML具有下列共同特征：白血病細胞易見Auer小體；髓過氧化物酶(POX)染色強陽性；常表達CD34、CD33、CD13、HIA．DR、CD19或CD56。該易位在分子水平上導致位于21號染色體長臂(21q22)的AML1基因與8號染色體長臂(8q22)的ETO基因并置，形成AML1/ETO融合基因，后者在白血病發(fā)病中起重要作用，其融合基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)檢測[6]。t(8;21)(q22;q22)伴額外染色體異常以性染色體丟失最常見，但同時伴del(9)(q22)較少見。在急性髓系白血病中伴del(9)(q22)約占2%，其缺失區(qū)域基因GKAP1、KIF27、C9ORF64、HNRNPK、 RMI1、 SLC28A3 和 NTRK2與白血病發(fā)生密切相關(guān)，其中HNRNPK.編碼核蛋白K是導致白血病發(fā)生的重要因子[7]。據(jù)文獻[8]報道，t(8;21)伴附加染色體異常組的緩解率及總生存期(OS)均低于單純t (8;21)組及正常核型組 (P<0.05)。有研究表明，初診時高WBC、有髓外浸潤、免疫表型表達CD56、染色體有附加9q-和性染色體缺失是t(8;21)預后不良的因素[8-10]。本案例45,X,-X,t(8;21)(q22;q22),del(9)(q22)，免疫表型有表達CD56，經(jīng)隨訪，該患兒因是早期，目前正在進行NOPHO-AML2004方案治療，7月19號流式復查未見免疫表型異常的髓系原始/幼稚細胞，現(xiàn)體征平穩(wěn)，后續(xù)情況將繼續(xù)追蹤隨訪。

綜上所述，血常規(guī)結(jié)合血涂片在兒童急性白血病早期診斷中具有重要的臨床價值，在工作中必須認真對待每一份標本，嚴格執(zhí)行每一項復檢規(guī)則，以防漏診。