譚亞芳, 吳嘉妍, 祁建勇, 張敏州△

1廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科(廣東廣州 510120); 2廣州中醫(yī)藥大學(廣東廣州 510006)

缺血性心臟病又稱冠狀動脈心臟病，是心臟供血不足所引起的疾病。近年來，缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升，已成為危害人類健康和生命的一大類疾病[1-2]。大量實踐證明，在心肌供血改善后，缺血受損的心肌功能不一定能夠恢復，可逆性損傷卻可能進一步加劇，出現(xiàn)如心律失常、心功能低下、出血性壞死、心臟衰竭加劇等情況[3-4]。如何有效地預防和減輕缺血損傷亟待解決。從中醫(yī)學理論上講，缺血性心臟病屬于“胸痹”、心痛”、“厥心病”等范疇，是本虛標實所致，氣虛為本，血瘀為標。通冠膠囊是根據(jù)鄧鐵濤教授學術思想和六十年的臨證經(jīng)驗，針對氣虛血瘀這一病機擬方而成，主要由黃芪、丹參、水蛭和冰片四味藥物組成，四藥合參,藥簡而力宏,共收益氣活血、祛瘀通脈之功效[5]。臨床研究表明，益氣活血中藥通冠膠囊具有改善冠心病介入治療術后心肌缺血,改善術后心室重構(gòu)及心功能,抑制術后再狹窄以及具有抗凝抗血小板等作用[6-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通冠膠囊后適應對大鼠心肌缺血模型表現(xiàn)出呈劑量依賴性的保護作用[10]，通冠膠囊能夠改善單個心肌細胞的收縮功能，減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷[11]，但具體的保護機制還有待進一步的研究，本研究起止時間為2018年1月至2020年3月。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 通冠膠囊主要由黃芪、丹參、水蛭、冰片等組成，由廣東省中醫(yī)院生產(chǎn)(批號:050802)。

1.2 實驗動物 本次實驗動物為體重(230±20)g清潔級雄性健康SD大鼠。所有動物實驗及飼養(yǎng)方案均遵照中華人民共和國動物處理條例(衛(wèi)生部，中華人民共和國，條例號：552001)，并且所有動物實驗均在廣東省中醫(yī)院動物倫理委員會允許下進行。所有實驗動物均購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，經(jīng)過嚴格及合格的檢疫。

1.3 主要試劑及儀器 異丙腎上腺素(ISO)(SIGMA公司)、美托洛爾(SIGMA公司)、PD98059(Cell Signaling Technology公司)、LY294002(Cell Signaling Technology公司)、KN93(Cell Signaling Technology公司)、L-NAME(Cell Signaling Technology公司)。7180全自動生化分析儀、Cobas e601電化學發(fā)光分析儀。

1.4 方法

1.4.1 實驗模型構(gòu)建 根據(jù)實驗要求，本實驗采用ISO誘導大鼠急性心肌缺血方法。參考本實驗室既往研究基礎制定手術方案，分別采用10 mg/kg的ISO皮下注射10 d，85 mg/kg的ISO皮下注射2 d,觀察對比兩者的造模效果，選用85 mg/kg的ISO皮下注射2 d構(gòu)建量效及機制實驗中的模型。

1.4.2 實驗動物分組及給藥方法

1.4.2.1 現(xiàn)象實驗 選取8～10周成年雄性SD大鼠50只，隨機分為對照組(NE組)10只；低劑量模型組(ISO-L組，10 mg/kg)、高劑量模型組(ISO-H組，85 mg/kg)10只；通冠組(TGC組)10只；美托洛爾組(METO組)10只,給藥方法見表1，ISO-L組連續(xù)給藥10 d，其余組連續(xù)給藥2 d。

表1 現(xiàn)象實驗分組設置

1.4.2.2 量效實驗 選取8～10周成年雄性SD大鼠80只，隨機分為：對照組(NE組)10只，模型組(ISO組)10只，美托洛爾組(METO組)10只，10 mg TGC組10只，50 mg TGC組10只，100 mg TGC組10只，500 mg TGC組10只，1 000 mg TGC組10只；重復操作連續(xù)2 d。給藥方法見表2。

表2 量效實驗分組設置

1.4.2.3 機制實驗 選取8～10周成年雄性SD大鼠60只，隨機分為模型組(ISO組)10只；TGC組[上午按體重皮下注射85 mg/(kg·d)ISO溶液，至少2 h后按體重給予TGC溶液灌胃處理]10只；PD98059組(PD組，上午先按體重腹腔注射1 mg/kg PD98059混懸液，至少0.5 h后按體重皮下注射85 mg/kg ISO溶液，再隔至少2 h按體重給予EC50劑量TGC灌胃處理)10只；LY294002組(LY組)10只；KN93組(KN組)10只；L-NAME組10只。給藥方法如表3所示。

表3 機制實驗分組設置

1.4.3 檢測指標

1.4.3.1 大鼠血液的心酶五項及肌鈣蛋白(cTnT)指標 由廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院檢驗科收取樣本，利用AST試劑盒、CK試劑盒、LDH試劑盒、CK-MB試劑盒、HBDH試劑盒、7180全自動生化分析儀檢測血液心酶五項的指標。利用Troponin T hs STAT試劑盒、Cobas e601電化學發(fā)光分析儀檢測血液cTnT的指標。

1.4.3.2 解剖大鼠取心、肺、肝、脛骨等組織重量及長度進行比較 解剖大鼠取心、肺、肝等組織，迅速稱量，同時解剖脛骨，游標卡尺讀出長度。以組織重量與脛骨長度做出比值。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)象實驗 各項指標均顯示，ISO-L(10 d)或ISO-H(2 d)處理后均較NE組檢測值高。心酶和cTnT檢測值顯示，ISO-H組心酶五項和cTnT的檢測值均較ISO-L組高，本實驗中使用85 mg/kg ISO連續(xù)皮下注射2 d為造模方法。心酶和cTnT檢測值顯示，TGC組和METO組心酶和cTnT的檢測值均較ISO組低。心酶和cTnT檢測值顯示，TGC組和METO組數(shù)據(jù)基本持平。見表4、圖1。

表4 現(xiàn)象實驗心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與NE組比較 #P<0.01, ##P<0.001; 與ISO-H組比較*P<0.05, **P<0.001

2.2 量效實驗 心酶五項和cTnT檢測值顯示，TGC給藥后，心酶五項和cTnT的檢測值均下降。量效曲線顯示，TGC對大鼠心肌缺血的改善作用隨藥物濃度的增加呈先增加后減小趨勢，其中最大斜率為3.602，EC50為38.94。心酶五項和cTnT檢測值顯示，當給予10 mg TGC時，心酶五項和肌鈣數(shù)據(jù)較ISO組下降不大。心酶五項和cTnT檢測值顯示，當TGC劑量達到1 000 mg/kg時，心酶五項和cTnT的檢測值均有所回升。心酶五項和cTnT檢測值顯示，以一定濃度梯度的TGC給藥后，不同給藥劑量時心酶五項和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg時下降幅度最大。見表5、圖2。

表5 量效實驗心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與ISO組比較 * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 與NE組比較 #P<0.01, ##P<0001

2.3 機制實驗 根據(jù)cTnT柱狀圖可知，PD組和LY組數(shù)據(jù)較ISO組明顯降低且基本與空白對照組持平。而KN組、L-NAME組數(shù)據(jù)則明顯上升且高于ISO組。心酶五項數(shù)據(jù)圖顯示，ERK通路和eNOS通路對TGC改善心肌缺血作用有影響且eNOS通路影響較ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路對TGC影響較小。解剖學數(shù)據(jù)顯示，給予TGC的各組數(shù)據(jù)均下降。根據(jù)解剖學數(shù)據(jù)顯示，給予藥物后肺脛比明顯比肝脛比數(shù)據(jù)下降。解剖學數(shù)據(jù)顯示，抑制劑組數(shù)據(jù)差別不大。見表6、圖3。

表6 機制實驗心酶及肌鈣數(shù)據(jù)表

注：與TGC組比較 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 討論

本實驗通過設計兩種大鼠心肌缺血造模方法，分別是連續(xù)10 d注射10 mg/kg(ISO-L組)和連續(xù)2 d注射85 mg/kg (ISO-H組)。通過測定心酶和肌鈣數(shù)據(jù)最終確定采用連續(xù)2 d皮下注射85 mg/kg ISO的方法構(gòu)建大鼠急性心肌缺血模型。建立缺血模型后通過TGC藥物干預，同時與心肌缺血治療藥物METO作為對照藥物進行對比。

在現(xiàn)象實驗中，觀察確定TGC其對大鼠急性心肌缺血有保護作用，通過血清學和解剖學各項指標均顯示，ISO-L或ISO-H處理后均較NE組檢測值高，說明ISO可導致大鼠心肌缺血損傷。心酶和cTnT檢測值顯示，ISO-H組心酶五項和cTnT的檢測值均較ISO-L組高，說明85 mg/kg ISO連續(xù)皮下注射2 d導致心肌損傷程度更高、心酶和cTnT檢測值顯示，TGC組和METO組心酶和cTnT的檢測值均較ISO組低，說明TGC和METO均對大鼠急性心肌缺血有改善作用。心酶和cTnT檢測值顯示，TGC組和METO組數(shù)據(jù)基本持平，說明1 g/kg TGC與10 mg/kg美托洛爾改善心肌缺血作用相似。證明了TGC對大鼠的心肌缺血具改善作用，并呈一定的劑量效應關系，且其改善心肌缺血作用優(yōu)于METO。

在確定TGC的保護作用后進行量效實驗，通過設計5個濃度藥物梯度，觀察藥物的最有效劑量。在量效實驗中，心酶五項和cTnT檢測值顯示，TGC給藥后，心酶五項和cTnT的檢測值均下降，再次證明TGC對大鼠急性心肌缺血有改善作用。量效曲線顯示，TGC對大鼠心肌缺血的改善作用隨藥物濃度的增加呈先增加后減小趨勢，其中最大斜率為3.602，EC50為38.94。心酶五項和cTnT檢測值顯示，當給予10 mg TGC時，心酶五項和肌鈣數(shù)據(jù)較ISO組下降不大，推測小劑量TGC對大鼠心肌缺血損傷的修復作用不明顯。心酶五項和cTnT檢測值顯示，當TGC劑量達到1 000 mg/kg時，心酶五項和cTnT的檢測值均有所回升，猜測在TGC治療大鼠急性心肌缺血時使用過高劑量對心肌損傷的修復作用不明顯或開始出現(xiàn)毒性不良反應。心酶五項和cTnT檢測值顯示，以一定濃度梯度的TGC給藥后，不同給藥劑量時心酶五項和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg時下降幅度最大，猜測當給藥劑量于100～500 mg/kg時TGC改善大鼠急性心肌缺血效果較好。

根據(jù)量效實驗結(jié)果得出的EC50進行機制實驗，以給藥組作對照組，實驗組則給予EC50濃度的藥物后注射相關通路的抑制劑，通過解剖學和血清學觀察探索其可能的作用機制。在機制實驗中，心酶五項和cTnT數(shù)據(jù)充分說明了TGC對ISO造成的大鼠心肌缺血有明顯改善作用。根據(jù)cTnT柱狀圖可知，PD組和LY組數(shù)據(jù)較ISO組明顯降低且基本與空白對照組持平，這一結(jié)果說明ERK1/2、AKT通路對TGC的改善作用影響不大。而KN組、L-NAME組數(shù)據(jù)則明顯上升且高于ISO組，推測KN和L-NAME對TGC對大鼠心肌缺血的改善作用有抑制效果且可能對心肌缺血有一定損傷作用，其作用可與ISO造成的心肌缺血作用疊加。心酶五項結(jié)果顯示，ERK通路和ENOS通路對通冠膠囊改善心肌缺血作用有影響且ENOS通路影響較ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路對TGC影響較小。推測TGC對大鼠心肌缺血的改善作用主要與eNOS通路有關。解剖學結(jié)果顯示，給予通冠膠囊的各組數(shù)據(jù)均下降，再次驗證了TGC對大鼠心肌缺血有改善作用。根據(jù)解剖學數(shù)據(jù)顯示，給予藥物后肺脛比比肝脛比數(shù)據(jù)下降明顯，推測藥物改善右心缺血優(yōu)于改善左心缺血。解剖學數(shù)據(jù)顯示，抑制劑組數(shù)據(jù)差別不大，無法通過解剖學確定TGC對心肌缺血改善作用的機制。本實驗用4種通路抑制劑阻斷對應通路，結(jié)果表明，eNOS抑制劑L-NAME處理后肌鈣心酶等指標均有明顯上升。本實驗提出通冠膠囊對大鼠急性心肌缺血的保護作用的主要通路可能為eNOS通路，ERK1/2和CaMKⅡ通路對TGC改善作用也有一定影響，但仍需從分子生物學及基因?qū)W方面進一步明確機制。

此次實驗初步研究了TGC對心肌缺血改善作用的量效和機制，但還存在很多不足之處。第一，量效實驗設計的5個濃度梯度范圍較大，可在此實驗基礎上進一步縮小濃度范圍，更好地探索藥物最有效劑量；第二，關于改善心肌缺血通路的文獻較少，并沒有過多數(shù)據(jù)支持所設計的抑制劑濃度為該抑制劑的最有效給予濃度；第三，由于改善心肌缺血通路的文獻較少，設計的通路除eNOS通路外其他通路結(jié)果不太理想，可在此基礎上進一步進行其他探索；第四，此次實驗全部為大鼠藥理實驗，下一步探索可設計分子蛋白實驗進一步明確TGC的作用。