林裕貴 龐夏鳳 李程頤 孫增輝 朱銀川 王熹婧 林春秀 張?jiān)龇?/p>

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，南寧市 530021，電子郵箱：18324180870@163.com；2 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇省無錫市 214122)

研究表明，H6N6亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)已經(jīng)在歐亞地區(qū)的野禽和家禽中廣泛流行，其感染宿主的范圍不斷擴(kuò)大，從主要感染水禽逐漸進(jìn)化為感染陸禽、哺乳動(dòng)物，甚至具有感染人類的潛能[1]。前期研究結(jié)果顯示，陸禽H6N6亞型AIV已經(jīng)具備感染哺乳動(dòng)物豬及人類的潛能[2-3]。水禽鴨、鵝在流感病毒生態(tài)系統(tǒng)中起非常重要的作用，然而水禽H6N6亞型AIV是否具有感染哺乳動(dòng)物豬及人類的潛能，目前仍未完全清楚。本研究將前期分離出的2株水禽流感病毒鴨H6N6亞型AIV A/DK/GX/750/2010(簡(jiǎn)稱GX750)、鵝H6N6亞型AIV A/GS/GX/399/2010(簡(jiǎn)稱GX399)，進(jìn)行基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，以了解其基因來源和基因特點(diǎn)，然后通過體外感染豬肺和人肺組織來檢測(cè)病毒的復(fù)制能力和組織病理改變，旨在探討水禽H6N6亞型AIV感染哺乳動(dòng)物豬及人類的潛能及其跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)，為H6N6亞型AIV的監(jiān)測(cè)和防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)毒株及組織標(biāo)本 兩株H6N6亞型AIV GX750、GX399分離于2010年廣西南寧市活禽交易市場(chǎng)；選擇先前已證實(shí)能在豬和人肺組織有效地復(fù)制的H9N2亞型AIVA/DK/GX/767/2010(簡(jiǎn)稱GX767)作為陽性對(duì)照病毒株。將病毒接種于10日齡的無特定病原體級(jí)雞胚(廣西富鳳農(nóng)牧集團(tuán)有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增，采用血凝試驗(yàn)和半數(shù)組織培養(yǎng)感染試驗(yàn)(50%tissue culture infective dose,TCID50)分別檢測(cè)病毒滴度和感染力(見表1)。新鮮豬肺組織取自4～5月齡的無特定病原體級(jí)巴馬香豬(廣西大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究所)，新鮮人肺組織取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肺組織切除手術(shù)標(biāo)本，所需組織標(biāo)本均獲廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意，所有實(shí)驗(yàn)均在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

表1 實(shí)驗(yàn)毒株的基本資料

1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、F12-K培養(yǎng)基、胎牛血清、TPCK-胰酶購自Gibco公司(批號(hào)：1810992、1854888、1715752、1832635)；鏈-青霉素購自Solarbio公司(批號(hào)：20160817)；免疫組化試劑盒、蘇木精染液、伊紅染液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司(批號(hào)：1703249720、141201445V、1001036198、17030701、1114AD23)；4%多聚甲醛購自Biosharp公司(批號(hào)：1608145)；小鼠源核蛋白抗體購自廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心；TRIzol購自Thermo公司(批號(hào)：50175111)；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、PCR反應(yīng)試劑PremixEx TaqTMVersion 2.0、DNA Marker試劑100 bp DNA Ladder購自TaKaRa公司(批號(hào)：AK2601、A120806A、100-55-2)；DNA膠回收試劑EasyPure? Quick Gel Extraction Kit購自TransGen公司(批號(hào)：L41118)；0.6%火雞紅細(xì)胞懸液由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室自配。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病毒基因測(cè)序：采用TRIzol法提取病毒RNA，采用國家流感中心提供的甲型流感病毒基因引物，反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA；使用PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA電泳，DNA膠回收試劑回收電泳膠進(jìn)行DNA純化，采用Illumina公司Solexa系統(tǒng)進(jìn)行全基因組測(cè)序。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 遺傳進(jìn)化分析：應(yīng)用BLAST程序?qū)芍闔6N6亞型AIV的8個(gè)基因片段進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用MEGA 7.0軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中的相關(guān)流感病毒為參考序列，采用最佳模型和最大似然法(參數(shù)設(shè)置為1000 replications) 繪制病毒基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，以進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.3.3 病毒體外感染肺組織：采集新鮮豬肺和人肺組織標(biāo)本，用F-12K培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，然后切除可疑病變組織，將剩余正常組織切成數(shù)塊，每塊體積約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm。體外感染前每種標(biāo)本隨機(jī)留取兩塊組織，分別行流感病毒核蛋白檢測(cè)和病毒分離培養(yǎng)，以明確本實(shí)驗(yàn)所選取的組織無流感病毒感染。每種標(biāo)本隨機(jī)選擇6塊組織分別置于4個(gè)6 mm培養(yǎng)皿中(3個(gè)感染組和1個(gè)空白組)，每1個(gè)感染組的培養(yǎng)皿接種1株病毒，分別加入2 mL含TCID50為106/mL的病毒的F-12K培養(yǎng)基，37℃、5% CO2吸附2 h，同時(shí)用F-12K培養(yǎng)基代替病毒液作為空白對(duì)照組。吸附完成后組織經(jīng)PBS反復(fù)沖洗3次后置于6孔板中，每孔放入2塊組織，用1 mL含0.2%TPCK-胰酶和1%鏈-青霉素的F-12K培養(yǎng)基37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，分別在接種后24 h、48 h、72 h隨機(jī)收獲一孔中的組織和培養(yǎng)上清液。其中，1塊組織加入4%多聚甲醛浸泡固定24 h，另1塊組織經(jīng)PBS反復(fù)沖洗3次后研磨為組織勻漿液。組織研磨液和培養(yǎng)上清液分別接種于10 d雞胚進(jìn)行病毒培養(yǎng)，然后行血凝試驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。

1.3.4 觀察組織病理改變：組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木精染液染色2 min、鹽酸酒精脫色、自來水返藍(lán)、伊紅染液染色3 min、梯度酒精脫水，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)病毒核蛋白的表達(dá)：組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，經(jīng)3% H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鈉緩沖液高溫高壓修復(fù)抗原，山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)，滴加一抗核蛋白抗體(1 ∶2 000)4℃過夜孵育，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG二抗，滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽性結(jié)果為鏡下呈棕黃色，主要位于細(xì)胞核，少量存在于核周細(xì)胞質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果 目前，H6亞型AIV可分為歐亞譜系和北美譜系，歐亞譜系可進(jìn)一步分為Ⅰ組(ST339-like)、Ⅱ組(ST2853-like)、Ⅲ組(HN573-like)3個(gè)主要分支[4]。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，兩株H6N6亞型 AIV GX750、GX399為同一重配病毒的不同變型，8個(gè)基因片段均來源于歐亞譜系的水禽源進(jìn)化分支，HA基因?qū)儆贕roup-Ⅱ(ST2853-like)主要分支中的A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支(圖1)，NA基因?qū)儆贏/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)分支(圖2)；其余內(nèi)部基因中，PA基因?qū)儆贏/duck/Guangxi/052/2010(H6N5)分支，NP、NS基因?qū)儆贏/duck/Guangxi/058/2010(H6N6)分支，M基因?qū)儆贏/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支，PB1基因?qū)儆贏/duck/Guangdong/S1663/2009(H6N6)分支，PB2基因?qū)儆贏/duck/Henan/S4179/2009(H4N6)分支。

圖1 AIV GX750和AIV GX399 的HA基因進(jìn)化樹

圖2 GX750和GX399 的NA基因進(jìn)化樹

2.2 體外感染豬肺和人肺組織后病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 病毒感染前采集的新鮮豬肺和人肺組織均未分離、檢測(cè)出流感病毒，表明本實(shí)驗(yàn)所采集的新鮮豬肺和人肺組織均未被流感病毒感染。兩株H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染豬肺和人肺組織后將組織勻漿及培養(yǎng)上清液接種于10 d雞胚，收獲尿囊液，采用血凝試驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果顯示，水禽兩株H6N6亞型AIV體外接種豬和人的肺組織后24 h、48 h、72 h，病毒分離培養(yǎng)均呈陽性(見表2)，表明兩株水禽源性H6N6亞型AIV可在哺乳動(dòng)物豬和人的肺組織有效地復(fù)制。

表2 兩株水禽H6N6亞型AIV接種豬肺和人肺組織后在雞胚分離培養(yǎng)的病毒滴度

2.3 體外感染豬肺和人肺組織后肺組織病理變化和流感病毒核蛋白組織嗜性 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可見豬肺組織和人肺組織感染病毒后呈現(xiàn)出不同程度的病理改變，豬肺組織表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)少量肺泡細(xì)胞壞死脫落，人肺組織則表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞和較多肺泡細(xì)胞壞死脫落以及炎癥細(xì)胞浸潤。H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染豬肺組織后，兩株病毒在豬肺組織內(nèi)均出現(xiàn)核蛋白表達(dá)，主要表達(dá)部位為肺泡細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞；H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染人肺組織后，兩株病毒在人肺組織同樣出現(xiàn)核蛋白表達(dá)，主要表達(dá)部位為肺泡細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞(圖3)。

圖3 兩株H6N6亞型AIV體外接種豬肺和人肺組織后的核蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

H6亞型AIV最初主要流行于野生水禽，隨后逐漸蔓延至鵝、家鴨、雞、鵪鶉等家禽，隨后在我國豬群中分離出了H6N6亞型流感病毒[5]。目前，在我國家禽中主要流行H6N2和H6N6，而H6N6已逐漸取代H6N2成為H6優(yōu)勢(shì)亞型[6]。值得注意的是，2013年中國臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生了首例人感染H6N1亞型AIV病例，表明H6亞型AIV可以實(shí)現(xiàn)跨種間屏障直接感染人類，其對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生安全的潛在威脅不容忽視[7]。目前認(rèn)為，禽流感病毒和人流感病毒分別主要與唾液酸SA-α-2,3Gal受體和SA-α-2,6Gal受體結(jié)合而感染對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞，其中SA-α-2,3Gal受體主要分布在人下呼吸道組織的肺泡、細(xì)支氣管及終末細(xì)支氣管，而SA-α-2,6Gal受體則主要分布于上呼吸道組織的氣管、支氣管，這種受體在呼吸道分布的生理結(jié)構(gòu)差異被認(rèn)為是AIV跨種間屏障感染人類的主要障礙[8]。水禽是流感病毒的天然宿主，從禽類、人類和其他哺乳動(dòng)物所分離得到的流感病毒幾乎都來源于水禽，因此水禽AIV是不同動(dòng)物流感病毒的先祖[9]。研究表明，中間宿主豬是AIV突破“禽類-人類”種間傳播障礙的重要宿主，豬的不同呼吸道結(jié)構(gòu)中均同時(shí)存在兩種流感病毒唾液酸受體，可同時(shí)感染禽流感病毒和人流感病毒，不同來源的流感病毒在豬體內(nèi)發(fā)生重配和適應(yīng)性突變，使其對(duì)人的感染能力增強(qiáng)[10]。此外，陸禽(如雞、鵪鶉等)也可充當(dāng)AIV進(jìn)化過程中的中間宿主，全球首例人感染H6N1亞型AIV以及近幾年流行的H7N9、H5N6 亞型AIV的基因均在雞體內(nèi)發(fā)生重配而產(chǎn)生[11-13]。但水禽H6N6亞型AIV是否可以感染哺乳動(dòng)物豬尚未清楚。本研究選擇的兩株H6N6亞型AIV GX399、GX750分別分離于水禽鵝、鴨，遺傳進(jìn)化分析表明其內(nèi)部基因均來源于水禽流感病毒，可作為水禽H6N6亞型AIV的研究毒株。本研究將兩株水禽H6N6亞型AIV體外感染豬肺組織，結(jié)果顯示，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)，豬肺組織勻漿液和培養(yǎng)上清液的病毒分離培養(yǎng)均呈陽性；核蛋白是流感病毒核糖核蛋白的主要成分，參與核內(nèi)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和胞質(zhì)病毒蛋白的翻譯[14]，免疫組化檢測(cè)結(jié)果提示豬肺組織的病毒核蛋白均呈陽性，陽性細(xì)胞主要是肺泡細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，表明病毒可在豬肺組織中有效地復(fù)制，其主要復(fù)制部位為肺泡組織；蘇木精-伊紅染色后觀察到豬肺組織出現(xiàn)肺泡細(xì)胞壞死及肺泡破壞，表明水禽H6N6亞型AIV感染豬肺部后可以引發(fā)肺組織損傷以及炎癥反應(yīng)，具有一定的致病性。因此，水禽H6N6亞型AIV具有感染哺乳動(dòng)物豬的潛能，水禽H6N6亞型AIV反復(fù)感染豬可以產(chǎn)生適應(yīng)性突變或與其他亞型病毒基因重配，一旦病毒進(jìn)化為能與人型SA-α-2,6Gal受體結(jié)合，極有可能可以直接感染人類。

為進(jìn)一步探討水禽H6N6亞型AIV是否具有感染人類的潛能，本研究應(yīng)用水禽H6N6亞型AIV體外接種人肺組織，結(jié)果顯示，人肺組織勻漿、培養(yǎng)上清液的病毒分離培養(yǎng)均為陽性，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示肺泡細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)病毒核蛋白陽性，人肺部組織出現(xiàn)細(xì)胞壞死脫落伴有炎癥反應(yīng)等病理改變，表明水禽H6N6亞型AIV可在人肺組織中有效地復(fù)制，提示該類病毒具有感染人的潛能。

綜上所述，在體外，水禽H6N6亞型AIV在哺乳動(dòng)物豬和人的肺組織中具有較好的復(fù)制能力，提示該病毒可以打破傳統(tǒng)的流感進(jìn)化演變途徑，由水禽源流感病毒直接跨種屬感染哺乳動(dòng)物，甚至可以直接跨種屬感染人類。因此，必須加強(qiáng)水禽H6N6亞型AIV的監(jiān)測(cè)，密切關(guān)注水禽H6N6亞型AIV的流行及進(jìn)化變異狀況。