陸霞娟，蔣海峰，馬晶晶

上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200093

胃癌是現(xiàn)今世界上最常見的癌癥之一，起源于胃部黏膜上皮的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高病死率和預(yù)后差等特點(diǎn)，浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素都是其致死因素。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者中有10%以上的病例顯示出家族遺傳史，人們至今仍為研究其潛在的機(jī)制及尋找生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)而努力[1-2]。胃癌患者因多為晚期確診，通常表現(xiàn)為預(yù)后不佳，因此，找到胃癌的診斷生物標(biāo)志物及隨訪復(fù)查至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，微小RNA(miRNAs)在胃癌等各類癌癥發(fā)生中具有重要作用，許多miRNAs已被作為治療胃癌的潛在靶點(diǎn)[3-4]。近期有研究報(bào)道微小RNA-127(miR-127)可作為腫瘤抑制劑，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-127可抑制胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[6]。乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白2(PALB2)是一種乳腺癌基因，自2015年以來有多項(xiàng)研究為PALB2及其他參與同源重組DNA修復(fù)的基因在胃癌風(fēng)險(xiǎn)中的作用提供依據(jù)[7-8]。但關(guān)于miR-127和PALB2在胃癌黏膜組織中的表達(dá)水平與臨床特征及預(yù)后相關(guān)性的研究鮮少報(bào)道。因此，本研究旨在探討胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2的表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，以期為胃癌的病情發(fā)展及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供有效依據(jù)，為進(jìn)一步探討胃癌的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年3月至2015年7月本院收治且已確診為胃癌患者120例作為研究對(duì)象，其中男67例、女53例，年齡34～82歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者經(jīng)鏡檢、活檢等手段檢查確診(患者均為胃體部發(fā)生潰瘍、結(jié)節(jié)隆起病變，少數(shù)表現(xiàn)為糜爛、菜花樣腫物)[9]，臨床資料完整；(2)全部患者均進(jìn)行手術(shù)切除治療，術(shù)前未進(jìn)行其他輔助性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)內(nèi)鏡及活檢確診為食管胃交界部腺癌、原發(fā)性惡性淋巴瘤、胃肉瘤患者[9-10]；(2)在近期進(jìn)行過化療或手術(shù)等治療的胃癌患者；(3)患有其他免疫系統(tǒng)疾病患者。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，經(jīng)患者和家屬知情并簽署同意書。

1.2儀器與試劑 高速低溫離心機(jī)(JW-3021HR)購自嘉文設(shè)備有限公司；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(RT2100C)購自德國(guó)IFP公司。UltraSYBR Mixture(Low ROX)[貨號(hào)：(CW0956)]購自康為世紀(jì)公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP441)購自北京天根生化有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(貨號(hào)：RR047AA)購自日本Takara公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及保存 在手術(shù)中取研究對(duì)象胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織(>5 cm)，用生理鹽水清理干凈，放入-80 ℃冰箱備用。

1.3.2胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織中miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 使用RNA提取試劑盒(天根)提取出胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)標(biāo)本中miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平。用U6、β-actin作為內(nèi)參對(duì)mRNA標(biāo)準(zhǔn)化，通過2-ΔΔCt計(jì)算miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平。用Primer 6.0和Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度為18～22 bp，擴(kuò)增長(zhǎng)度100～300 bp，見表1，送華大基因進(jìn)行合成，經(jīng)10倍稀釋備用。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物(5′-3′)

1.4隨訪 對(duì)出院患者進(jìn)行為期5年的隨訪，以電話或復(fù)查形式記錄患者預(yù)后生存情況。

2 結(jié) 果

2.1癌旁黏膜組織和胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平比較 癌旁黏膜組織中miR-127相對(duì)表達(dá)水平高于胃癌黏膜組織，而PALB2相對(duì)表達(dá)水平則低于胃癌黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 癌旁黏膜組織和胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-127和PALB2相對(duì)表達(dá)水平分別以中位數(shù)0.23和2.02為標(biāo)準(zhǔn)，大于中位數(shù)為高表達(dá)組，低于或等于中位數(shù)為低表達(dá)組。由表3可知，兩組胃癌黏膜組織中miR-127和PALB2相對(duì)表達(dá)水平在不同性別、分化程度、年齡和腫瘤大小間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度和TNM分期間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 miR-127、PALB2相對(duì)表達(dá)水平與胃癌患者生存狀況的關(guān)系見圖1、2。經(jīng)過5年隨訪后，120例患者24例生存，96例死亡，生存率為20.00%。miR-127高表達(dá)組生存率為30.00%，miR-127低表達(dá)組生存率為10.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PALB2低表達(dá)組生存率為31.67%，而PALB2高表達(dá)組生存率為8.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4COX生存回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素 將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)程度、PALB2相對(duì)表達(dá)水平和miR-127相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行單因素COX生存回歸分析，發(fā)現(xiàn)以上5個(gè)因素均對(duì)患者預(yù)后存在影響(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)程度、PALB2高表達(dá)和miR-127低表達(dá)均是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

注：1為高表達(dá)組；2為低表達(dá)組；3為高表達(dá)組-檢剔后；4為低表達(dá)組-檢剔后。

表4 胃癌患者預(yù)后的COX生存回歸分析

注：1為高表達(dá)組；2為低表達(dá)組；3為高表達(dá)組-檢剔后；4為低表達(dá)組-檢剔后。

3 討 論

胃癌是除了肝癌和肺癌之外的第三大致命性癌癥，因大多數(shù)患者患病晚期才得到確診，導(dǎo)致預(yù)后不佳，因此病死率較高[11-12]。在解剖學(xué)上，胃癌分為胃腺癌和胃食管交界處腺癌，在組織學(xué)上可分為彌散型和腸型[11]。胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)因素有病毒感染、性別、年齡、飲酒史等，現(xiàn)今也有大量關(guān)于胃癌遺傳性的研究，以期在胃癌預(yù)防和治療方面取得突破性的進(jìn)展[13]。張瀟怡[14]在關(guān)于胃癌易感性和預(yù)后相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)MSH6、MLH11和MUTHY等基因與胃癌的發(fā)生有關(guān)。

miRNAs是一種非編碼的單鏈小分子RNA，在真核生物細(xì)胞中廣泛存在，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞異常分化和過度增殖，從而引發(fā)癌變[15]。彭洪等[16]研究表明，miR-127-5p高表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖起抑制作用，其在癌變組織中的表達(dá)水平低于正常組織。還有研究表明胃癌發(fā)生與miR-127的表達(dá)異常有關(guān)，通過蛋白印跡分析miR-127的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中其表達(dá)水平低于正常組織[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁黏膜組織相比，胃癌黏膜組織中miR-127相對(duì)表達(dá)水平降低，與上述研究結(jié)果一致。這表明miR-127可對(duì)胃癌的癌細(xì)胞起抑制作用，其表達(dá)降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖[16]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌黏膜組織中miR-127相對(duì)表達(dá)水平在性別、分化程度、年齡和腫瘤大小間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度和TNM分期間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明miR-127可影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。miR-127高表達(dá)組生存率為30.00%，miR-127低表達(dá)組生存率為10.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且miR-127低表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明miR-127可作為預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)用以跟蹤病情發(fā)展?fàn)顩r。

PALB2是一種乳腺癌基因，其突變可增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。還有研究表明PALB2會(huì)增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，是一種癌癥易感基因[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁黏膜組織相比，胃癌黏膜組織中PALB2相對(duì)表達(dá)水平增加，并且PALB2相對(duì)表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度和TNM分期間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明其相對(duì)表達(dá)水平增加可致使腫瘤的發(fā)生。PALB2低表達(dá)組生存率為31.67%，而PALB2高表達(dá)組生存率為8.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，PALB2高表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果表明，PALB2作為新的家族性胃癌基因，可對(duì)胃癌的治療和預(yù)防重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌黏膜組織miR-127低表達(dá)、PALB2高表達(dá)，二者與臨床特征密切相關(guān)，且PALB2高表達(dá)和miR-127低表達(dá)均是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果表明，miR-127、PALB2具有作為胃癌患者預(yù)后不良生物標(biāo)志物的潛在能力，但兩者在胃癌中的詳細(xì)作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。