任亞文，張甲龍，賀 蕾，張碧瑩，張 娜

銅川市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西銅川 727000

嗜血桿菌是兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原菌，其中流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌居多。流感嗜血桿菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，可引起多種感染，包括中耳炎、會(huì)厭炎、鼻竇炎和肺炎[1-2]。流感嗜血桿菌的傳播主要通過(guò)直接接觸攜帶者的呼吸道飛沫。新生兒可能會(huì)因吸入羊水或接觸含有活菌的生殖道分泌物而感染[3-4]。如果未能及時(shí)有效治療，流感嗜血桿菌感染可能會(huì)危及生命，例如引起菌血癥和腦膜炎[5]。副流感嗜血桿菌為呼吸道正常菌群，但是人體免疫力下降時(shí)可能引起急慢性呼吸道感染或其他疾病。青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物是治療兒童呼吸道感染的主要經(jīng)驗(yàn)性用藥，近年來(lái)，隨著臨床抗菌藥物廣泛應(yīng)用，嗜血桿菌的耐藥菌株不斷增多，給臨床治療帶來(lái)很大困難[6-7]。本研究旨在收集2018年臨床住院患兒中分離的114株嗜血桿菌進(jìn)行調(diào)查研究，以期為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 臨床住院患兒(0～14歲)送檢的合格痰液樣本，對(duì)其進(jìn)行涂片鏡檢，每個(gè)低倍鏡視野內(nèi)鱗狀上皮細(xì)胞少于10個(gè)，白細(xì)胞多于25個(gè)，視為合格痰液樣本。選取114株嗜血桿菌分離自2018年1月1日至12月31日兒科住院患兒的合格痰液樣本。

1.2儀器與試劑

1.2.1培養(yǎng)基來(lái)源 嗜血桿菌巧克力平皿(用于分離)購(gòu)自鄭州安圖公司，藥敏HTM培養(yǎng)基購(gòu)自溫州康泰公司。

1.2.2鑒定和藥敏紙片 鑒定用Vitek2 Compact及配套NH(VITEK 2 NH Test Card,NH)奈瑟菌/嗜血桿菌鑒定卡。用于測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的頭孢硝噻吩試劑和藥敏試驗(yàn)選用的12種抗菌藥物紙片：氨芐西林(10 μg)、阿莫西林/克拉維酸(20/10 μg)、阿奇霉素(15 μg)、頭孢曲松(30 μg)、亞胺培南(10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(100/10 μg)、美羅培南(10 μg)、頭孢呋辛(30 μg)、復(fù)方磺胺甲噁唑(25 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢他啶(30 μg)、左氧氟沙星(5 μg)購(gòu)自溫州康泰公司。血清學(xué)分型所用生化管購(gòu)自溫州康泰公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(4版)》[8]進(jìn)行操作，將各種以劃線分離法接種于嗜血桿菌巧克力平皿，孵箱(5%CO2，35 ℃)培養(yǎng)18～24 h。自嗜血桿菌巧克力平皿挑取呈無(wú)色、透明、表面光滑、邊緣整齊、似露滴狀的濕潤(rùn)可疑菌落，進(jìn)行革蘭染色，分純后菌落配3.0麥?zhǔn)蠞岫染荷螻H卡鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果選取流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌，并接種蔗糖、木糖和甘露糖生化管進(jìn)行血清學(xué)分型，35 ℃孵育24 h。

1.3.2藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)《抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判定，溫州康泰公司的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49247為質(zhì)控菌株，使用紙片擴(kuò)散法對(duì)12種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定用頭孢硝噻吩紙片[9]，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，并判斷陰陽(yáng)性。10 min內(nèi)變紅表示β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，不變色表示其為陰性。β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213,陰性質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3.3嗜血桿菌生物學(xué)分型結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 流感嗜血桿菌根據(jù)吲哚、脲酶試驗(yàn)及鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)，分為8個(gè)生物分型，見(jiàn)表1。

表1 嗜血桿菌生物學(xué)分型結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET 5.6分別統(tǒng)計(jì)流感與副流感嗜血桿菌菌株耐藥性情況，采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析不同年齡段患者之間耐藥率，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡段患者菌株分離情況 本地區(qū)流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、埃及嗜血桿菌分離情況見(jiàn)表2。

表2 不同年齡段患者菌株分離情況(n)

2.2菌株的生物學(xué)分型 銅川地區(qū)流感嗜血桿菌生物學(xué)流行株主要為Ⅱ型(32.00%)和Ⅲ型(30.00%)，副流感嗜血桿菌生物學(xué)流行株以Ⅲ型(38.46%)為主。見(jiàn)表3。

表3 嗜血桿菌生物學(xué)分型(%)

2.3藥敏情況比較 流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌對(duì)左氧氟沙星、美羅培南、亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦這4種抗菌藥物敏感率均較高，未檢測(cè)出耐藥菌株。流感嗜血桿菌與副流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、阿奇霉素和復(fù)方磺胺甲噁唑敏感率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。經(jīng)過(guò)頭孢硝噻吩紙片試驗(yàn)，β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)株78株，占比68.42%，陰性36株中，氨芐西林耐藥6株，占比為16.67%。

表4 流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況(%)

續(xù)表4 流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況(%)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，嗜血桿菌感染主要為0～<1歲患兒，這與孫曹瑋[10]和文獻(xiàn)[11]報(bào)道結(jié)果相符。流感嗜血桿菌是引起嬰幼兒呼吸系統(tǒng)感染的常見(jiàn)病原菌之一，并在健康嬰幼兒鼻咽部具有較高的定植率。免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全，是嬰幼兒流感嗜血桿菌感染率高的原因之一[12]。

本研究發(fā)現(xiàn),2018年銅川地區(qū)流感嗜血桿菌菌株生物學(xué)分型以Ⅱ型(32.00%)和Ⅲ型(30.00%)為主，這與胡俊等[13]報(bào)道結(jié)果不同，提示其可能存在地區(qū)間差異性。副流感嗜血桿菌株生物學(xué)分型以Ⅲ型為主，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道結(jié)果不同。這提示不同地區(qū)之間嗜血桿菌流行株不同。迄今為止,流感嗜血桿菌生物學(xué)分型與其毒力和耐藥的關(guān)系尚不十分清楚，尚待進(jìn)一步研究。氨芐西林作為治療嗜血桿菌感染的首選藥物，隨著使用的增加，該菌對(duì)其的耐藥率也逐年上升[14]。本研究中流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為68.06%，低于溫曉崢等[15]報(bào)道結(jié)果，但明顯高于孫燕等[16]報(bào)道結(jié)果。副流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為73.17%。

本研究發(fā)現(xiàn)，嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥率和β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性率均超過(guò)50.00%，說(shuō)明本院嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制主要以產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶為主。另外，本研究中114株嗜血桿菌中β-內(nèi)酰胺酶陰性嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥占16.67%，高于秦惠宏等[17]報(bào)道結(jié)果，可能是青霉素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其對(duì)氨芐西林的親和力下降及外膜蛋白發(fā)生改變[18]。

綜上所述，目前產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的嗜血桿菌分離株占比較高，表明氨芐西林已不能作為臨床一線藥物，而且兒童感染的嗜血桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性已十分嚴(yán)重。因此，對(duì)嗜血桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)從而指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物具有重要意義。但是，本次研究樣本量偏小，來(lái)源單一，且抗菌藥物與菌種的匹配度亦有待完善，故上述結(jié)論尚有待大樣本、多中心的前瞻性研究來(lái)予以驗(yàn)證。