王塹儐，郁夢(mèng)雅，魏 寵，楊春璐，史榮久，韓斯琴，張 穎

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽(yáng) 110036；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽(yáng) 110016）

向油藏中注水來(lái)提高原油采收率（簡(jiǎn)稱(chēng)水驅(qū)）是原油開(kāi)采非常重要且核心技術(shù)之一［1-2］.但是，硫酸鹽還原菌（SRB）能利用隨注入水進(jìn)入的硫酸鹽及其他含硫化合物進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，產(chǎn)生H2S，導(dǎo)致油藏酸?。?～6］.酸敗過(guò)程對(duì)油田開(kāi)發(fā)產(chǎn)生多種危害，例如，SRB可引發(fā)或促進(jìn)金屬管線等設(shè)施腐蝕［7］；硫化氫是有毒有害氣體，對(duì)人身健康和生命安全具有潛在威脅；油氣中增加的硫化氫會(huì)降低油氣價(jià)值，增加后續(xù)的加工成本.因此，深入認(rèn)識(shí)引發(fā)油藏酸敗的微生物的特征與代謝機(jī)制，研發(fā)有效的防控技術(shù)對(duì)油田開(kāi)發(fā)具有重要意義.

長(zhǎng)期以來(lái)，SRB一直被認(rèn)為是引發(fā)油田酸敗的主要微生物類(lèi)群.但是近年來(lái)已有研究顯示，有些油田中的微生物不能利用硫酸鹽（即“非硫酸鹽還原菌”），而能夠利用單質(zhì)硫、硫代硫酸鹽等產(chǎn)生硫化氫.考慮到油藏環(huán)境的巨大異質(zhì)性和微生物組成的復(fù)雜多樣性，深入認(rèn)識(shí)這些非SRB及其活性抑制對(duì)于油田酸敗控制具有重要價(jià)值.

目前，油田企業(yè)主要采用向注入水中投加化學(xué)殺菌劑的方法控制油藏酸?。?-6］.但是，長(zhǎng)期使用同一種化學(xué)殺菌劑會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性，造成使用劑量加大、費(fèi)用增高的后果［8］.此外，環(huán)境法規(guī)的限制和對(duì)環(huán)境敏感地區(qū)油庫(kù)的開(kāi)發(fā)刺激了易于降解的“綠色”殺菌劑的研究與使用［9］，許多毒性大的殺菌劑在應(yīng)用上受到嚴(yán)格限制.因此，篩選高效、低毒、低成本的殺菌劑仍具有持續(xù)的需要.殺菌劑篩選與使用受SRB種類(lèi)及代謝活性、油藏水質(zhì)環(huán)境等因素影響［3，10］.在油田環(huán)境中，由于環(huán)境復(fù)雜性導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有很大的差異［11］，同一種殺菌劑的使用對(duì)于油藏酸敗的控制效果具有不確定性.鑒于此，在深入了解特定油田硫化氫產(chǎn)生菌（SPB）生理生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上，針對(duì)特定微生物種群進(jìn)一步開(kāi)展殺菌劑篩選與效果評(píng)價(jià)，是提高油藏酸敗控制技術(shù)效果的關(guān)鍵［12-13］.

前期調(diào)研結(jié)果顯示，我國(guó)西北某油田多數(shù)油井經(jīng)長(zhǎng)期水驅(qū)采油后，井口采出水中H2S濃度大于50 mg/L，油田酸敗特征明顯.本文采用Hungate厭氧純培養(yǎng)技術(shù)從典型酸敗油井采出水中成功分離得到了一株優(yōu)勢(shì)的硫化氫產(chǎn)生菌WX-1，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序并結(jié)合菌株生理生化特性分析初步確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位；重點(diǎn)評(píng)價(jià)了2種抑菌劑及5種殺菌劑對(duì)該優(yōu)勢(shì)SPB生長(zhǎng)及產(chǎn)H2S活性的抑制效果.本文研究結(jié)果拓展了我國(guó)油田酸敗微生物成因的理論認(rèn)識(shí)，并為酸敗防控提供了技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 油田采出水的采集與預(yù)處理

從西北某油田一口發(fā)生嚴(yán)重酸敗的采油井采集采出液.用預(yù)先除菌的高密度聚乙烯塑料桶（10.0 L）從采出井采集采出液（原油與采出水的混合物），完成取樣后迅速加蓋密封，然后盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行油水分離后，將油井采出水進(jìn)行混合用于SPB菌株篩選和水質(zhì)基本理化性質(zhì)測(cè)定.表1為油井采出水的基本理化性質(zhì).

表1 西北某油田1口酸敗油井采出水的基本理化性質(zhì)Tab.1 Characteristics of the produced water from a soured well of an oilfield in northwest China

1.2 培養(yǎng)基

將STM培養(yǎng)基［14］適當(dāng)改進(jìn)后富集篩選采出水中的硫化氫產(chǎn)生菌.改進(jìn)后的培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)M）成分為：乳酸鈉（50%）2.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，Na2SO41.0 g/L，酒石酸鉀鈉1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，Na2S2O30.2 g/L，檸檬酸鐵銨0.2 g/L，NaCl 7.0 g/L，抗壞血酸0.1 g/L.在培養(yǎng)基M中按1.8%的比例加入瓊脂條即為固體培養(yǎng)基.培養(yǎng)基的終pH為7.0～7.2.在1×105Pa條件下，高溫蒸汽滅菌30 min.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)N）成分為：乳酸鈉（50%）2.5 g/L，Na2S2O31 g/L，酵母膏1 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 7.0 g/L，抗壞血酸0.1 g/L.培養(yǎng)基的終pH為7.0～7.2.在1×105Pa條件下，高溫蒸汽滅菌30 min.該培養(yǎng)基N用于SPB純菌株的唯一電子供體、受體利用及影響因子實(shí)驗(yàn)（詳見(jiàn)1.3.3節(jié)）.使用培養(yǎng)基N評(píng)價(jià)菌株可利用電子供體及影響因子實(shí)驗(yàn)時(shí)，在滅菌后的培養(yǎng)基N內(nèi)另補(bǔ)充過(guò)0.22μm濾膜的4 g/L硫酸亞鐵銨溶液0.2 mL.使用培養(yǎng)基N評(píng)價(jià)純菌株電子供體利用試驗(yàn)時(shí)，用等量的待評(píng)測(cè)電子供體取代乳酸鈉；評(píng)價(jià)純菌株電子受體利用試驗(yàn)時(shí)，用等量的待評(píng)測(cè)電子受體取代硫代硫酸鈉；通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基N中的NaCl濃度和pH梯度，評(píng)價(jià)SPB純菌株在不同礦化度或pH條件下的生長(zhǎng)特性.培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌等過(guò)程均按照厭氧微生物培養(yǎng)基制備方法完成［15］.厭氧瓶或厭氧管頂空氣體均為高純氮?dú)猓∟2純度≥99.99%）.以上所有試劑均為分析純等級(jí).

1.3 SPB分離篩選、優(yōu)勢(shì)菌株的生理特性及初步鑒定

1.3.1 SPB富集與菌株分離篩選 用無(wú)菌注射器取5 mL采出水混合物轉(zhuǎn)接至已滅菌的95 mL液體培養(yǎng)基M的厭氧瓶中進(jìn)行富集，然后將厭氧瓶置于37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫靜止培養(yǎng).待厭氧瓶?jī)?nèi)液體培養(yǎng)基變黑（5 d；形成的FeS黑色沉淀表明菌株的生長(zhǎng)）后，取厭氧瓶?jī)?nèi)富集好的液體培養(yǎng)液1 mL，用9 mL生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)ㄗ畹拖♂尪葹?0-5），采用Hungate滾管法［16］分離篩選SPB純菌株.在超凈臺(tái)內(nèi)挑取厭氧管內(nèi)生長(zhǎng)良好的SPB菌落，將其接種至含有10 mL液體培養(yǎng)基M的厭氧管中再次培養(yǎng)；為了獲得SPB純菌株，待厭氧管內(nèi)液體培養(yǎng)基變黑后，重復(fù)梯度稀釋、滾管分離、液體培養(yǎng)等步驟至少3次，直至獲得SPB純菌株（通過(guò)光學(xué)顯微鏡鏡檢與16S rRNA基因測(cè)序判定）.

1.3.2 SPB菌株16S rRNA基因序列分析 篩選分離獲得的SPB純菌株基因組DNA由天跟生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）提取.采用NanoDrop 2000（Thermo，USA）檢測(cè)提取菌株的DNA純度與濃度.采用細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增SPB菌株的16S rRNA基因片段.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)后再在72℃延伸10 min.在80 V電壓下使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否有條帶產(chǎn)生.將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.獲得的序列經(jīng)拼接、去除載體序列等處理后，通過(guò)BLASTn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析.通過(guò)比對(duì)結(jié)果選取菌株近緣序列后，采用MEGA X軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1000.

1.3.3 優(yōu)勢(shì)SPB菌株細(xì)胞形態(tài)與生理生化特性評(píng)價(jià) 選取1.3.2節(jié)中所獲得的最優(yōu)勢(shì)“種”所對(duì)應(yīng)的SPB純菌株，通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)觀察.掃描電鏡的菌液前處理步驟為：收集適量體積的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPB菌液，在10 000 g離心15 min，用生理鹽水重懸潤(rùn)洗菌體，重復(fù)離心、洗滌步驟3次；置于2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液中，于4℃固定過(guò)夜；次日以0.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液重懸清洗菌體，然后依次使用40%、70%、90%、100%乙醇溶液分別脫水處理15 min，脫水后使用冷凍保護(hù)劑叔丁醇置換乙醇，于12 000 g條件下離心15 min后，將樣品于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，鍍膜處理后通過(guò)掃描電鏡（Quanta 250，Holland，荷蘭飛利浦公司）查看菌株形態(tài)并拍照.SPB純菌株掃描電鏡拍照在中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)所分析檢測(cè)中心完成.

參照文獻(xiàn)［17-18］完成優(yōu)勢(shì)SPB純菌株生理生化特性評(píng)測(cè).待評(píng)測(cè)的唯一電子供體（碳源）包括D-果糖、葡萄糖、甘油、蔗糖、乳糖、乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、0.5%原油；待評(píng)測(cè)的唯一電子受體包括Na2SO3、Na2SO4、Na2S2O3、單質(zhì)硫、NaNO3、NaNO2.當(dāng)評(píng)測(cè)NaNO3、NaNO2時(shí)，SPB菌株不會(huì)產(chǎn)生H2S即菌液觀察不到變黑，此時(shí)采用監(jiān)測(cè)零時(shí)和第30 d時(shí)菌液OD600的變化.此外，使用培養(yǎng)基N考察溫度、pH、礦化度（以NaCl計(jì)）對(duì)優(yōu)勢(shì)SPB菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)H2S代謝活性的影響.共設(shè)4個(gè)溫度梯度，分別為14℃、37℃、45℃、60℃；使用HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，分別為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、10.0；通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基內(nèi)NaCl濃度至0%、0.5%、1%、3%、5%、10%、15%、20%，考察菌株的耐鹽性.生理生化特性試驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)處理的接菌量為5%，同時(shí)設(shè)“不接菌”的對(duì)照處理；當(dāng)評(píng)測(cè)唯一電子供體、電子受體時(shí)，同時(shí)設(shè)“不接菌”和“接菌但不添加待評(píng)測(cè)電子供體或電子受體”的對(duì)照處理.所有處理均設(shè)2個(gè)重復(fù).除了溫度影響評(píng)價(jià)試驗(yàn)外，所有實(shí)驗(yàn)處理組均置于37℃生化培養(yǎng)箱中靜止恒溫培養(yǎng).第30 d時(shí)取樣測(cè)定厭氧管內(nèi)菌液中H2S質(zhì)量濃度.

1.4 不同殺菌劑及硝酸鹽、亞硝酸鹽添加對(duì)優(yōu)勢(shì)SPB菌株產(chǎn)H2S活性的影響

選取五種化學(xué)殺菌劑，即戊二醛、次氯酸鈉（NaClO）、溴硝醇、四羥甲基硫酸磷（Tetrakis-hydroxymethyl phosphonium sulfate，THPS）和芐基三甲基氯化銨（benzyl trimethyl ammoniumchloride，BTAC），各設(shè)5個(gè)濃度梯度，評(píng)價(jià)不同殺菌劑不同使用劑量對(duì)優(yōu)勢(shì)SPB菌株產(chǎn)H2S活性的影響；另設(shè)5個(gè)不同濃度梯度的硝酸鈉及亞硝酸鈉，評(píng)價(jià)不同使用劑量對(duì)優(yōu)勢(shì)SPB產(chǎn)H2S活性的影響（表2）.以5%的接種比例取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)勢(shì)SPB菌液，所有厭氧管于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫靜止培養(yǎng)35 d，定期取樣測(cè)定H2S質(zhì)量濃度變化.所有試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行.

1.5 分析測(cè)定

表2 五種不同殺菌劑及硝酸鹽、亞硝酸鹽的評(píng)測(cè)濃度Tab.2 Concentrations of five biocides，nitrate and nitrite used for test

2 結(jié)果與分析

2.1 西北某油田采出水中的優(yōu)勢(shì)SPB菌株篩選

采用厭氧Hungate純培養(yǎng)技術(shù)，從采出水樣品中成功篩選到了28株SPB純菌株.經(jīng)NCBI測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，這28株純菌株屬于4個(gè)不同的“種”，分別包含16個(gè)、4個(gè)、7個(gè)和1個(gè)菌株.從包含菌株數(shù)量最多的組別中挑選1個(gè)菌株作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行后續(xù)研究，優(yōu)勢(shì)菌株編號(hào)為WX-1.

2.2 菌株WX-1的細(xì)胞形態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及生理生化特性

WX-1在固體培養(yǎng)基M上生長(zhǎng)時(shí)外觀為黑色圓形菌落；掃描電鏡結(jié)果如圖1所示，WX-1細(xì)胞呈球形，平均直徑約為0.48μm.

圖1 掃描電鏡下硫化氫產(chǎn)生菌菌株WX-1細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Scanning electron micrograph of SPB strain WX-1

圖2 以16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)的菌株WX-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain WX-1 constructed by neighbor-joining method with 16S rRNA gene sequences

圖2為基于16S rRNA基因序列信息構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).WX-1與Anaerosolibacter carboniphilus16S rRNA基因序列的序列相似性最高達(dá)99%.該結(jié)果表明兩者的親緣關(guān)系最近.

如表3所示，本試驗(yàn)選取了12種電子供體及6種電子受體進(jìn)行評(píng)測(cè).結(jié)果顯示：菌株WX-1能利用12種電子供體進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，其中最適碳源為丙酸鈉；能利用Na2S2O3、單質(zhì)硫?yàn)槲ㄒ浑娮邮荏w產(chǎn)H2S，當(dāng)Na2SO4、Na2SO3、NaNO3和NaNO2作為唯一電子受體進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，菌株WX-1不能生長(zhǎng)代謝；菌株WX-1具有運(yùn)動(dòng)性，胞內(nèi)氧化酶及過(guò)氧化氫酶均為陽(yáng)性，能產(chǎn)生吲哚，可以利用檸檬酸鹽，糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性.

表3 菌株WX-1的基本生理生化特性Tab.3 Physio-biochemical characteristics of isolate WX-1

2.3 溫度、pH及礦化度對(duì)WX-1生長(zhǎng)及產(chǎn)H2S活性的影響

圖3所示為不同環(huán)境條件對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性影響.WX-1能夠在37℃～45℃生長(zhǎng)且產(chǎn)生H2S；第30 d時(shí)，在37℃條件下厭氧管內(nèi)WX-1產(chǎn)H2S的質(zhì)量濃度最大，提示它的最適生長(zhǎng)溫度為37℃；在4℃和60℃的條件下，菌株WX-1生長(zhǎng)非常緩慢，幾乎沒(méi)有H2S產(chǎn)生.在37℃條件下，菌株WX-1在pH為7～10的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)且產(chǎn)生H2S；第30 d時(shí)，WX-1在pH為7時(shí)厭氧管內(nèi)產(chǎn)生H2S的質(zhì)量濃度最大，提示它的最適pH為7.在37℃條件下，菌株WX-1的生長(zhǎng)不需要鈉離子，在NaCl濃度為0%～5%的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)且產(chǎn)生H2S，但在NaCl濃度為10%及以上條件下菌株WX-1不能產(chǎn)H2S；第30 d時(shí)，WX-1在NaCl濃度為3%的厭氧管內(nèi)產(chǎn)H2S的質(zhì)量濃度最大，提示它的最適礦化度為3%.

圖3 溫度、pH及礦化度對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性的影響Fig.3 Effects of temperature，pH and salinity on the H2S-producing activity by isolate WX-1

2.4 添加不同殺菌劑對(duì)WX-1產(chǎn)H2S活性的影響

添加不同濃度的戊二醛對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性的影響如圖4 a所示.終質(zhì)量濃度為40 mg/L的戊二醛僅能抑制WX-1產(chǎn)H2S的活性7 d，在14 d時(shí)該處理組內(nèi)H2S質(zhì)量濃度已經(jīng)超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照組內(nèi)H2S的產(chǎn)生量；終質(zhì)量濃度為60 mg/L和80 mg/L的戊二醛均能夠抑制WX-1產(chǎn)H2S的活性14 d，14 d后無(wú)法抑制住H2S的產(chǎn)生.該結(jié)果表明，終質(zhì)量濃度為80 mg/L的戊二醛不能夠長(zhǎng)期抑制WX-1產(chǎn)H2S的活性.

添加不同濃度的次氯酸鈉對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性的影響如圖4 b所示.添加終質(zhì)量濃度為400 mg/L的次氯酸鈉時(shí)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)厭氧管內(nèi)H2S質(zhì)量濃度值與陽(yáng)性對(duì)照組具有顯著性不同（P＜0.05），但該濃度的次氯酸鈉仍無(wú)法抑制住菌株WX-1生長(zhǎng)代謝.第35 d時(shí)，添加100～400 mg/L的次氯酸鈉的各處理組厭氧管內(nèi)H2S質(zhì)量濃度均能達(dá)到11 mg/L左右.該結(jié)果表明，菌株WX-1對(duì)次氯酸鈉具有一定的耐受能力.

如圖4 c所示，使用10 mg/L及以上質(zhì)量濃度的溴硝醇時(shí)，菌株WX-1產(chǎn)H2S的活性被抑制超過(guò)35 d.該結(jié)果表明，菌株WX-1對(duì)溴硝醇比較敏感，溴硝醇具有高效抑制西北某油田微生物酸化的潛力.

添加不同濃度的THPS對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性的抑制效果如圖4 d所示.盡管加入50 mg/L的THPS后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)厭氧管內(nèi)H2S質(zhì)量濃度與對(duì)照組具有顯著性差異（P＜0.05），使用終質(zhì)量濃度為50 mg/L的THPS仍無(wú)法有效抑制WX-1的產(chǎn)H2S活性.當(dāng)THPS的終質(zhì)量濃度高于100 mg/L時(shí)，菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性被有效抑制，WX-1在35 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)沒(méi)有H2S產(chǎn)生.該結(jié)果表明，THPS也具有高效抑制西北某油田微生物酸化的潛力.

添加不同濃度的BTAC對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性的影響如圖4 e所示.添加終質(zhì)量濃度高達(dá)200 mg/L的BTAC也無(wú)法抑制住WX-1的產(chǎn)H2S活性.

圖4 不同殺菌劑對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S的抑制效果Fig.4 Efficacies of biocides to inhibit the H2S production by isolate WX-1

2.5 添加硝酸鹽及亞硝酸鹽對(duì)WX-1產(chǎn)H2S活性的影響

添加不同濃度的硝酸鹽對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性抑制效果如圖5 a所示.終質(zhì)量濃度200～600 mg/L的硝酸鈉無(wú)法抑制菌株WX-1產(chǎn)生H2S.盡管添加終質(zhì)量濃度為1000 mg/L的硝酸鈉后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)厭氧管內(nèi)H2S質(zhì)量濃度值與不加硝酸鹽的陽(yáng)性對(duì)照組具有顯著性不同（P＜0.05），該質(zhì)量濃度的硝酸鹽仍無(wú)法抑制住菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性；第35 d時(shí)仍能檢測(cè)到厭氧管內(nèi)H2S產(chǎn)生，但同陽(yáng)性對(duì)照組相比，H2S質(zhì)量濃度大大降低.該結(jié)果表明，高濃度的硝酸鹽雖無(wú)法完全抑制住菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性，但可降低菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性.

添加亞硝酸鹽對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S活性有顯著抑制作用（如圖5 b）.終質(zhì)量濃度為50 mg/L的亞硝酸鈉僅能夠短期抑制WX-1的產(chǎn)H2S活性；當(dāng)超過(guò)7 d時(shí)，雖然各時(shí)間節(jié)點(diǎn)厭氧瓶?jī)?nèi)H2S質(zhì)量濃度值與不加亞硝酸鹽的陽(yáng)性對(duì)照組具有顯著性不同（P＜0.05），但該濃度的亞硝酸鹽仍無(wú)法抑制住菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性.在35 d試驗(yàn)周期內(nèi)，質(zhì)量濃度高于50 mg/L的三個(gè)處理組（100、150、200 mg/L）瓶?jī)?nèi)未檢出H2S，表明菌株WX-1的生長(zhǎng)被亞硝酸鹽強(qiáng)烈抑制.

圖5 硝酸鹽及亞硝酸鹽添加對(duì)菌株WX-1產(chǎn)H2S的影響Fig.5 Effects of nitrate or nitrite on the H2S production by isolate WX-1

3 討論

3.1 菌株WX-1與近緣種Anaerosolibacter carboniphilus生理生化特性的差異

本文從我國(guó)西北某油田1口油井的采出水中成功篩選了1株優(yōu)勢(shì)SPB菌株WX-1.WX-1與A.carboniphilus16S rRNA基因序列的序列相似性最高，達(dá)99%.該結(jié)果表明兩者的親緣關(guān)系最近.A.carboniphilus首次從韓國(guó)煤污染土壤中被分離出來(lái)［19］，并以鐵還原菌被報(bào)道，關(guān)于其在油田內(nèi)的存在還未見(jiàn)報(bào)道.菌株WX-1與A.carboniphilus模式菌株IRF19T的形態(tài)及生理生化差異明顯：①形態(tài)上，模式菌株IRF19T為寬度0.4～0.6μm、長(zhǎng)度2.0～5.0μm的直桿狀，而菌株WX-1為平均直徑0.48μm的球狀；②在溫度方面，模式菌株IRF19T相對(duì)菌株WX-1具有稍加廣泛的溫度范圍.IRF19T最低耐受溫度為20℃，而WX-1在37～45℃下生長(zhǎng)；③模式菌株IRF19T在pH為6.5～10.0的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，而WX-1僅能在pH為7.0～9.0下生長(zhǎng)；④超過(guò)2%的NaCl濃度會(huì)抑制模式菌株IRF19T的生長(zhǎng)，而菌株WX-1的最適礦化度為3%，且WX-1在NaCl濃度為0%～5%內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)生H2S；⑤模式菌株IRF19T具有更廣泛的電子受體，其能利用單質(zhì)硫、硫酸鹽和硫代硫酸鹽，而WX-1不能利用硫酸鹽進(jìn)行生長(zhǎng)代謝；但菌株WX-1能利用乳酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，模式菌株IRF19T不能利用這四種碳源進(jìn)行生長(zhǎng).這些研究結(jié)果提示，盡管基于16S rRNA基因序列信息初步確定菌株WX-1與A.carboniphilus具有親緣關(guān)系，但在形態(tài)及生理生化方面的差異較大.

3.2 硫化氫產(chǎn)生菌對(duì)油藏酸敗的貢獻(xiàn)

目前，人們普遍認(rèn)為SRB的生長(zhǎng)代謝是導(dǎo)致油藏酸敗的根本原因［7］.但有研究表明，許多SPB不能利用硫酸鹽，卻能利用單質(zhì)硫或者其他含硫化合物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生H2S.非洲產(chǎn)油井中分離出來(lái)的Thermotoga（模式菌株SEBR 7054T）能夠還原硫代硫酸鹽，而不能將硫酸鹽或硫還原為硫化物［20］.耐酸和適度嗜熱的硫還原菌Desulfurella amilsi（模式菌株TR1T）能夠利用單質(zhì)硫和硫代硫酸鹽作為電子受體，不能還原硫酸鹽，亞硫酸鹽，硝酸鹽和三價(jià)鐵，其中單質(zhì)硫是實(shí)現(xiàn)最高硫化物濃度和最快生長(zhǎng)的電子受體［21］.Thiofractor thiocaminus（模式菌株496ChimT）將S0用作能源和硫源，其他含硫化合物尚未影響該菌株的生長(zhǎng)［22］.同以上三種菌株類(lèi)似，本文篩選到的一株硫化氫產(chǎn)生菌WX-1能利用硫代硫酸鈉、單質(zhì)硫作為唯一電子受體，而不能利用硫酸鹽、亞硫酸鹽.該結(jié)果提示非硫酸鹽還原菌的硫化氫產(chǎn)生菌可能是西北某油田造成油田酸敗的主因.因此，非硫酸鹽還原菌的硫化氫產(chǎn)生菌對(duì)于油藏酸敗同樣有著重大貢獻(xiàn)，造成的后果不容忽視；該菌在油田中參與的硫循環(huán)過(guò)程、機(jī)制值得進(jìn)一步探討.

3.3 殺菌劑的添加對(duì)于抑制硫化氫產(chǎn)生菌代謝活性的差異

不同油田中，由于其環(huán)境復(fù)雜性導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異；即便在同一個(gè)油田中，不同地理位置也會(huì)造成微生物群落結(jié)構(gòu)變化［13］.因此，同一種殺菌劑抑制或殺死SPB的使用劑量顯著不同.有研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用30 mg/L的戊二醛可有效抑制Desulfovibrio desulfuricanssubsp的代謝活性116 h（細(xì)胞濃度約為2.2×108CFU/mL）［23］.對(duì)于加拿大Coleville油田研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，500 mg/L的戊二醛或者800 mg/L的溴硝醇才能抑制住SRB的代謝活性［11］.而本實(shí)驗(yàn)中，10 mg/L的溴硝醇能抑制菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性，該質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于加拿大Coleville油田酸敗控制所需的溴硝醇濃度.在尼日利亞油田中，THPS在200 mg/L質(zhì)量濃度下對(duì)采出水中SRB的生長(zhǎng)僅有明顯抑制作用，在400 mg/L質(zhì)量濃度下能完全抑制住SRB生長(zhǎng)（細(xì)胞濃度約為105CFU/mL）［24］.本實(shí)驗(yàn)中，100 mg/L的THPS即能完全抑制住菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性.另有研究表明，在印度Kathloni油田中，單獨(dú)添加25 mg/L的BTAC或者次氯酸鈉在2 h內(nèi)即可殺死從該油田采出水中得到的SRB（初始數(shù)量108CFU/mL）［25］.但在本實(shí)驗(yàn)中，添加終質(zhì)量濃度200 mg/L的BTAC和400 mg/L的次氯酸鈉也無(wú)法抑制菌株WX-1的產(chǎn)H2S活性.該結(jié)果提示，溴硝醇和THPS可以較高效地殺死西北某油田油藏中的SPB優(yōu)勢(shì)菌株，在西北某油田油藏酸敗控制中可能具有較大的應(yīng)用潛力.

4 結(jié)論

1）通過(guò)厭氧Hungate滾管技術(shù)從西北某油田采出水中成功分離得到了1株硫化氫產(chǎn)生菌WX-1，其16S rRNA基因序列與A.carboniphilus的序列相似性最高達(dá)99%.該菌株能利用多種碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，僅能利用單質(zhì)硫和硫代硫酸鹽作為唯一電子受體產(chǎn)生H2S；

2）非硫酸鹽還原菌的硫化氫產(chǎn)生菌同樣可以造成油藏酸?。?/p>

3）相比硝酸鹽，亞硝酸鹽對(duì)WX-1抑制效果明顯，亞硝酸鹽是潛在的有效抑制劑；

4）終質(zhì)量濃度為10 mg/L的溴硝醇或100 mg/L的THPS可單獨(dú)抑制菌株WX-1，是潛在的高效殺菌劑.