劉 暉 趙春英 鄭 潔 王 鳳 楊華鋒 王建東

三陰性乳腺癌是一種具有高度侵襲性的乳腺癌，患者常表現(xiàn)出耐藥性，靶向治療效果不佳[1]。冬凌草甲素是香茶菜屬植物中含量較高雙萜類生物堿，具有明確的抗腫瘤功效[2]，但對于其抑制乳腺癌細胞的作用和機制尚未有深入研究。本研究著重考察冬凌草甲素對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468的抗癌活性，并從細胞增殖和凋亡角度，探索冬凌草甲素抑制乳腺癌細胞的作用機制，為其在臨床的進一步應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與抗體

DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher，lot No.2024699)；FBS(GIBCO，No.10091148)；冬凌草甲素(曼斯特，No.MUST-17041120)；DMSO(Life science，No.0236C042)；青霉素(Life science，No.1842944)，鏈霉素(GIBCO，No.1846496)。MDA-MB-468人乳腺癌細胞購自浙江如耀生物科技有限公司?？贵w均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 MTT法

采用MTT比色法檢測乳腺癌細胞增殖活性。將細胞制成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度冬凌草甲素(1.25、2.5、5、10、20、40 μM，以加等量不含藥培養(yǎng)基為對照組)，孵育48 h后，每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min。以560 nm為檢測波長，630 nm為參比波長，測定吸光值，并以不加藥的培養(yǎng)基孵育48 h作為空白對照，計算冬凌草甲素對乳腺癌細胞的抑制率。

1.3 DAPI染色

MDA-MB-468細胞爬片，冬凌草甲素干預24 h，預冷70%乙醇固定，加入DAPI染液(1 μg/ml)染色2～3 min，去掉染料后PBS漂洗一次，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)特征。

1.4 細胞凋亡

采用Annexin-FITC流式檢測試劑盒檢測細胞凋亡水平。將MDA-MB-468細胞加冬凌草甲素處理24 h后，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106/ml。吸取100 μl的細胞懸液，加入400 μl結(jié)合緩沖液，加5 μl Annexin V/FITC和10 μl 20 μg/ml的碘化丙啶溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，進行流式檢測。

1.5 Western-blot分析

收集陰性對照組及冬凌草甲素處理24 h后的MDA-MB-468細胞，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解5 min，12 000 rpm/min離心10 min后取上清，加入5×上樣緩沖液，于100 ℃變性5 min。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL顯色試劑盒進行顯影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J分析條帶灰度值，計算蛋白相對含量。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對乳腺癌細胞增殖的影響

冬凌草甲素分別作用24 h和48 h后，進行MTT測試。結(jié)果顯示，冬凌草甲素對MDA-MB-468細胞有明顯抑制，冬凌草甲素10 μM作用48 h后抑制率可達到(97.24±6.21)%，隨后提高濃度其抑制率不再增加(圖1)。因此，后續(xù)選擇10 μM為冬凌草甲素作用濃度用于研究。

圖1 冬凌草甲素對乳腺癌細胞的抑制趨勢

2.2 冬凌草甲素對乳腺癌細胞形態(tài)的影響

冬凌草甲素處理后的MDA-MB-468細胞數(shù)量隨著作用濃度增加而明顯減少，在10 μM時，大量細胞變圓，從培養(yǎng)皿中脫離。隨后，根據(jù)DAPI染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)未加冬凌草甲素的空白對照組細胞核較完整，未見明顯凋亡形態(tài)。冬凌草甲素處理后，高倍鏡下可見部分細胞呈典型凋亡形態(tài)，表明冬凌草甲素可誘導細胞凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡的細胞增多。

2.3 冬凌草甲素對乳腺癌細胞周期的影響

冬凌草甲素干預后，MDA-MB-468細胞周期結(jié)果如圖2所示，G2/M期細胞比例均有明顯增加，且與冬凌草甲素濃度成正相關，對照組中G2/M期比例為(14.07±4.01)%，而冬凌草甲素作用濃度達到10 μM時，MDA-MB-468的G2/M比例增加至(26.26±2.61)%；同時S期和G0/G1期的細胞比例降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明冬凌草甲素可將細胞周期阻滯在G2/M期。

2.4 冬凌草甲素對乳腺癌細胞凋亡的影響

將冬凌草甲素處理24 h后的MDA-MB-468細胞進行Annexin V/PI雙染色，結(jié)果顯示，早期凋亡(Q1-LR區(qū)域)和晚期凋亡(Q1-UR區(qū)域)細胞比例均隨冬凌草甲素作用的濃度增加而逐漸提高，體現(xiàn)在UR和LR區(qū)域細胞比例的逐漸提高，說明冬凌草甲素能夠誘導細胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖3。

圖3 冬凌草甲素對乳腺癌細胞凋亡的影響

2.5 冬凌草甲素對增殖和凋亡有關蛋白的影響

MDA-MB-468細胞經(jīng)冬凌草甲素處理，免疫印跡分析表明，p53表達隨著冬凌草甲素作用濃度的增加而提高，PARP總蛋白水平在10 μM時下調(diào)，其活化形式隨濃度增加而上調(diào)。細胞凋亡相關蛋白包括cleaved Caspase-3(Caspase-3活化形式)、cleaved Caspase-9(Caspase-9活化形式)以及Cyt.C(細胞色素c)隨著作用濃度的增加而上升。隨著冬凌草甲素濃度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平隨之下調(diào)，誘導凋亡蛋白Bax則有增加的趨勢。見圖4。以上結(jié)果進一步提示，冬凌草甲素可通過啟動內(nèi)源和外源性途徑誘導乳腺癌細胞凋亡。

圖4 免疫印跡結(jié)果

3 討論

冬凌草甲素已被證實具有廣泛的抗腫瘤效果[3]。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對胃癌細胞[4]、結(jié)直腸癌細胞[5]，白血病細胞[6]等都有一定的抑制作用。在研究冬凌草甲素抗腫瘤機制時發(fā)現(xiàn)，它還可以通過增加細胞周期相關蛋白的磷酸化來激活細胞周期檢查點，從而影響細胞周期進程，進一步發(fā)揮對腫瘤細胞的抑制作用[7-8]。在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可促進SPC-A-1細胞中Bax表達，而抑制Bcl-2的表達，從而促進肺癌細胞凋亡[9]。在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，冬凌草甲素不僅改變Bax/Bcl-2的表達，而且可促進細胞色素c從線粒體的釋放，從而觸發(fā)線粒體凋亡途徑[10]。

目前尚無針對三陰性乳腺癌的專用藥物，臨床上采用阿霉素等抗癌藥在一定程度上抑制乳腺癌的發(fā)展，但是存在較大副作用。而冬凌草甲素可能通過促凋亡和抗血管生成作用協(xié)同增強阿霉素對侵襲性乳腺癌的抗腫瘤作用，從而降低阿霉素帶來的副作用[11]。也有報道冬凌草甲素可以聯(lián)合卡培他濱顯著提高對MDA-MB-231人乳腺癌細胞的抑制率[12]。本研究的MTT測試結(jié)果顯示，冬凌草甲素能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖。DAPI染色直觀顯示了冬凌草甲素可以抑制乳腺癌細胞的增殖。細胞周期及細胞凋亡實驗結(jié)果則顯示冬凌草甲素可將細胞阻滯于G2/M期，這與先前在乳腺癌細胞MCF-7中觀察到的結(jié)果一致[13]。

為進一步探討冬凌草甲素抑制乳腺癌細胞增殖的機制，本文還對細胞增殖和凋亡途徑相關蛋白表達量進行檢測。細胞凋亡途徑可初略分為內(nèi)源性和外源性途徑，最終都通過Caspase-3活化啟動凋亡進程，外源性途徑以Caspase-9的活化等為代表，而內(nèi)源性途徑則以線粒體膜上Cyt.c的釋放為代表。p53是調(diào)節(jié)細胞存活和凋亡的關鍵蛋白，已有研究證明p53可同時誘導內(nèi)源性和外源性凋亡的發(fā)生[14]。p53上調(diào)以后意味著細胞損傷后的監(jiān)控增強，有DNA損傷的細胞無法進入復制周期，繼而走向凋亡。三陰性乳腺癌患者中約有80%以上存在p53突變，近年也有發(fā)現(xiàn)部分化合物可重新激活突變型p53，將其恢復為野生型構(gòu)象，且在乳腺癌臨床前模型中均表現(xiàn)出活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素作用于MDA-MB-468細胞后，p53表達量上調(diào)，說明冬凌草甲素能增加抑癌蛋白表達，促進細胞周期阻滯，從而抑制細胞增殖。同時，研究還發(fā)現(xiàn)在冬凌草甲素的干預下，乳腺癌細胞凋亡相關蛋白Caspase-3，Caspase-9和PARP被活化，Cyt.c的表達增加。在本研究中顯示，冬凌草甲素可同時啟動內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導細胞死亡。由此可以推斷，冬凌草甲素不僅抑制細胞增殖，而且可誘導乳腺癌細胞的凋亡，其主要機制可能在于上調(diào)p53的水平?？傊?，冬凌草甲素可能通過上調(diào)p53水平，導致細胞監(jiān)控加強，錯誤細胞無法進入復制周期，最終導致細胞凋亡。

綜上所述，冬凌草甲素能夠有效抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-468的增殖，阻滯細胞周期，促進乳腺癌細胞凋亡，且其作用效果在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性。其初步作用機理為通過上調(diào)p53表達，活化細胞凋亡途徑關鍵蛋白Caspase 3、Caspase-9 和PARP。后期我們將考慮進一步的體內(nèi)研究以明確其對三陰性乳腺癌的抑制效果。