黃麥玲 孫晴 王桂榮 李文勝 杜亞東 蔡寶云 黃海榮 李琦 初乃惠

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染而導(dǎo)致的腦膜非化膿性、亞急性或慢性感染性疾病，發(fā)病率雖僅占結(jié)核病的1%～5%[1]，但死亡率及中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率卻高達50%[2]。腦脊液(cerebral spinal fluid，CSF)中找到MTB是TBM診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法常導(dǎo)致診斷延誤，不利于患者預(yù)后。而核酸擴增技術(shù)因較傳統(tǒng)方法可明顯提高病原學(xué)檢測敏感度，且耗時短，在近些年發(fā)展迅速，尤以超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因(Xpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)檢測技術(shù)表現(xiàn)突出。

目前，對Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的研究還較少[3-8]，且多存在研究樣本量偏小、研究對象多為TBM并發(fā)HIV感染者、研究結(jié)果不一致等問題。又由于CSF菌陰(涂片及培養(yǎng))TBM患者中MTB的荷菌量較培陽TBM患者更少，導(dǎo)致目前還沒有評估Xpert Ultra對CSF菌陰TBM患者診斷價值的相關(guān)研究。另外，Xpert Ultra主要通過增加多拷貝序列IS6110/IS1081來提高其檢測敏感度，然而，由于流行的MTB菌株因國家或地區(qū)而異，其IS6110/IS1081的數(shù)量也差別較大[9-10]，故有必要評估不同地區(qū)TBM患者應(yīng)用Xpert Ultra檢測的診斷價值。為此，筆者通過擴大樣本量來評估Xpert Ultra檢測CSF對我國HIV陰性TBM的診斷價值，為 Xpert Ultra的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

1.一般情況：連續(xù)納入2017年1月至2018年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院就診的189例疑似TBM患者，依據(jù)入組及診斷標(biāo)準(zhǔn)最終納入151例患者。其中，TBM患者(TBM組)106例，包括32例確診、55例很可能、19例可能；非TBM患者(非TBM組)45例，包括18例病毒性腦膜炎、12例細(xì)菌性腦膜炎、7例隱球菌性腦膜炎、3例惡性腫瘤、3例癲癇和2例腦血管疾病。所有患者HIV檢測和CSF抗酸染色涂片鏡檢均為陰性；TBM患者中有30例因CSF標(biāo)本少而未行CSF中 MTB的BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(以下簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)，60例(56.6%)患者在采集CSF前進行了1～120 d的抗結(jié)核藥物治療。兩組患者基本人口學(xué)及臨床特征見表1。

表1 不同人口學(xué)特征及臨床特征在結(jié)核性腦膜炎組和非結(jié)核性腦膜炎組分布情況

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照國際統(tǒng)一的TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]分為確診、很可能和可能TBM。(1)確診：具備腦膜炎癥狀或體征，同時具備CSF抗酸染色涂片鏡檢、培養(yǎng)、核酸擴增檢測均陽性，或腦組織病理表現(xiàn)與結(jié)核病病理表現(xiàn)一致且同時抗酸染色陽性等MTB病原學(xué)任一陽性者；(2)很可能：有頭顱CT或MRI檢查，且TBM臨床評分≥12分；無頭顱CT或MRI檢查者，TBM臨床評分≥10分；同時除外其他疾病，但CSF或頭顱影像學(xué)評分至少2分；(3)可能TBM：有頭顱CT或MRI檢查者，TBM臨床評分6～11分；無頭顱CT或MRI檢查患者，TBM臨床評分6～9分；同時除外其他疾病。如果頭顱CT和MRI檢查、腰椎穿刺均未做，則不能診斷或除外TBM。非TBM指需要與TBM進行鑒別診斷的疾病。

3.入組標(biāo)準(zhǔn)：所有因病情需要行腰椎穿刺檢查，且無腰椎穿刺禁忌證并同意入組的疑似TBM患者。有以下情況之一者均需排除：未明確診斷、并發(fā)HIV感染、無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀、CSF標(biāo)本量不足、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和Xpert Ultra檢測結(jié)果不確定。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)[編號：(2018)年臨審第(21)號]，且所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.主要儀器及試劑：BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)基分枝桿菌生長指示管(美國Becton Dickinson公司)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)。Xpert檢測儀、Xpert和Xpert Ultra 檢測試劑盒(美國賽沛公司)；中性羅氏培養(yǎng)基(珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司)；7H9培養(yǎng)基粉和利福平藥粉(美國Sigma公司)。

2.CSF留取：留取患者腰椎穿刺后常規(guī)檢查剩余的CSF標(biāo)本至少3 ml，其中，1 ml CSF標(biāo)本凍存于-80 ℃擬行Xpert Ultra檢查，其余CSF直接行Xpert、抗酸染色涂片鏡檢和培養(yǎng)。

3.實驗方法：抗酸染色涂片鏡檢、培養(yǎng)及表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[12]進行標(biāo)準(zhǔn)化操作。Xpert和Xpert Ultra的檢測步驟嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明操作，報無效結(jié)果者使用相同樣本重復(fù)進行Xpert Ultra或Xpert檢測。

4.結(jié)果的判讀：根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)和所檢測探針的陽性情況對Xpert Ultra檢測MTB菌量的半定量進行估計，分為“高”“中”“低”“極低”或“痕量”。Ct值介于15～18.9表示“高”，19～24.9表示“中”，25～28.9表示“低”，29～40表示“極低”，而“痕量”表示IS6110/IS1081陽性但rpoB陰性的少菌標(biāo)本。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，偏態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示，兩組間差異的比較采用Manne-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料采用“百分率或構(gòu)成比(%)”表示，兩組間差異的比較采用χ2檢驗(當(dāng)總樣本數(shù)≥40，理論頻數(shù)≥5時)或Fisher精確概率法(當(dāng)總樣本數(shù)<40，理論頻數(shù)<5時)；兩組配對資料的比較采用McNemar卡方檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率、Kappa值評估Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培養(yǎng)對TBM的診斷效能，其中，敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總患者例數(shù)×100%；Kappa值≥0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性一般；Kappa值<0.4，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。采用維恩圖展示Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培養(yǎng)檢測CSF陽性的患者例數(shù)。

結(jié) 果

一、 Xpert Ultra檢測CSF中MTB的負(fù)荷情況

Xpert Ultra對45例非TBM患者的檢測結(jié)果均為陰性；而對106例TBM患者的檢測陽性結(jié)果為47例，包括14例(29.8%)MTB負(fù)荷半定量估計為“低”者，13例(27.6%)為 “極低”者，20例(42.6%)為“痕量”者，無“高”和“中”結(jié)果。同時，Xpert對106例TBM患者的檢測陽性結(jié)果為26例，其中14例為培養(yǎng)陽性者。

二、 Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值

以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測106例 TBM患者的敏感度和特異度分別為44.3%(47/106)和100.0%(45/45)，而Xpert為24.5%(26/106)和100.0%(45/45)，二者敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.000，P<0.01)。Xpert Ultra檢測76例行CSF培養(yǎng)的TBM患者的敏感度為44.7%(34/76)，而MGIT 960培養(yǎng)的敏感度僅為18.4%(14/76)，二者敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.893，P<0.01)。具體見表2。

表2 Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養(yǎng)以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測腦脊液對TBM的診斷效能

三、 Xpert Ultra檢測CSF對很可能和可能TBM的診斷價值

Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養(yǎng)檢測CSF的陽性者分別為47、26、14例，其中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養(yǎng)檢測CSF單一陽性者分別為21、2、4例(圖1)。當(dāng)結(jié)合Xpert Ultra檢測結(jié)果重新診斷TBM時，55例很可能和19例可能的TBM患者中分別有17例(30.9%)和4例(21.1%)被納入，則對TBM的確診率從30.2%(32/106)提高至50.0%(53/106)。

四、 Xpert Ultra檢測CSF不同培養(yǎng)結(jié)果TBM患者的診斷價值

在行CSF標(biāo)本MGIT 960培養(yǎng)的76例TBM患者中，Xpert Ultra對62例(81.6%)培養(yǎng)陰性患者檢測的陽性率[38.7%(24/62)]明顯高于Xpert[21.0%(13/62)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.692，P=0.003)；而對14例培養(yǎng)陽性患者檢測的陽性率[71.4%(10/14)]與Xpert[57.1%(8/14)]的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.500，P=0.500)，且Xpert Ultra和Xpert對培養(yǎng)陽性患者的檢測敏感度[分別為71.4%(10/14)和 57.1%(8/14)]均高于其對培養(yǎng)陰性TBM患者的檢測敏感度[分別為 38.7%(24/62)和21.0%(13/62)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.925，P=0.026；Fisher精確概率檢驗，P=0.017)。

五、 抗結(jié)核治療對Xpert Ultra檢測CSF的影響

Xpert和Xpert Ultra對接受抗結(jié)核治療TBM患者CSF的陽性檢出率[分別為13.3%(8/60)和20.0% (12/60)]均明顯低于未接受抗結(jié)核治療患者[分別為39.1%(18/46)和76.1%(35/46)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.360，P=0.002；χ2=33.189，P<0.01)。且兩種方法對接受抗結(jié)核治療的TBM患者的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.125，P=0.289)，但Xpert Ultra對未接受抗結(jié)核治療的TBM患者的陽性檢出率明顯高于Xpert(χ2=15.059，P<0.01)。

六、 Xpert Ultra檢測CSF對利福平耐藥檢測結(jié)果的分析

14例經(jīng)CSF培養(yǎng)陽性且完成表型藥敏試驗的TBM患者中，經(jīng)Xpert和Xpert Ultra同時檢出rpoB基因突變者1例，未檢出rpoB基因突變者5例，與表型藥敏試驗結(jié)果一致；另外8例患者中，3例僅Xpert檢出無rpoB基因突變，其中1例Xpert Ultra檢測利福平耐藥結(jié)果不確定，2例Xpert Ultra檢測陰性；2例僅Xpert Ultra檢出無rpoB基因突變，其中1例Xpert檢測利福平耐藥結(jié)果不確定，1例Xpert檢測陰性；1例Xpert Ultra檢出存在rpoB基因突變但Xpert檢測為陰性；2例Xpert及Xpert Ultra檢測結(jié)果均為陰性。另外，62例 CSF培養(yǎng)陰性的TBM患者中，Xpert Ultra和Xpert分別檢出14例和12例發(fā)生rpoB突變，其中兩種方法均檢出rpoB基因突變者1例。

討 論

TBM是預(yù)后最差的結(jié)核病，及時診治能明顯改善患者預(yù)后，但目前尚缺乏較理想的診斷方法。Xpert檢測系統(tǒng)因其具有全封閉、全自動化操作、污染可能性小、人為錯誤少、結(jié)果精確度高、檢測周期短、敏感度高等優(yōu)勢[13-14]，已成為具有里程碑意義的結(jié)核病診斷新方法。但Xpert對菌量較少標(biāo)本的檢測敏感度較低[15]，而新一代Xpert Ultra在原有Xpert反應(yīng)體系及設(shè)備上進行了改進，使檢測MTB的低限從Xpert的112.6 CFU/ml下降至15.6 CFU/ml[10]，并縮短檢測周期至84 min，檢測少菌標(biāo)本(如肺外結(jié)核、MTB/HIV雙重感染、兒童結(jié)核病等)的敏感度也較Xpert明顯增高[16]。因此，WHO于2017年3月推薦新一代Xpert Ultra檢測方法可以替代Xpert用于結(jié)核病診斷[17]。

本研究顯示，在106例臨床診斷為TBM(包括確診、很可能、可能TBM)的患者中， Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的敏感度(44.3%)明顯高于Xpert(24.5%)和MGIT 960培養(yǎng)(18.4%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與Wang等[3]對43例HIV陰性TBM患者的研究結(jié)果一致。2018年，Bahr等[4]首次應(yīng)用Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960快速培養(yǎng)對23例HIV陽性的TBM患者進行離心后CSF檢測，在確診和很可能的TBM患者中，Xpert Ultra檢測的敏感度(69.6%)高于Xpert(43.5%)。2020年，Cresswell等[5]采用前瞻性隊列研究的方法進行了51例TBM患者的研究，發(fā)現(xiàn)Xpert Ultra檢測CSF的敏感度(76.5%)高于Xpert(55.6%)和MGIT 960培養(yǎng)(61.4%)，結(jié)果與上述研究一致。但本研究中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養(yǎng)檢測CSF的敏感度均低于文獻[4]研究結(jié)果，可能與以下原因有關(guān)：其一，研究發(fā)現(xiàn)Xpert Ultra檢測CSF培養(yǎng)陽性患者的陽性率高于培養(yǎng)陰性患者，提示Xpert Ultra檢測CSF的陽性率與其荷菌量相關(guān)。其二，基于有研究認(rèn)為HIV陽性的TBM患者CSF中的MTB荷菌量高于HIV陰性的TBM患者[18]，本研究未納入HIV陽性TBM患者，而文獻[4]納入了HIV陽性的TBM患者。其三，本研究以確診、很可能、可能的TBM患者作為研究對象，而文獻[4]僅以確診和很可能TBM患者作為研究對象，使得本研究對荷菌量更低的“可能TBM患者”的檢出能力降低，且有可能是非TBM。其四，越來越多的證據(jù)表明，較大量的CSF可以增加Xpert及Xpert Ultra診斷TBM的敏感度[7, 19]。本研究采用未離心的1 ml CSF進行檢測，而文獻[4]采用較大量(≥3 ml)的CSF行離心后檢查，增加了細(xì)菌負(fù)荷，進一步提高了檢測敏感度。最后，Thwaites等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核治療6～15 d行核酸檢測的敏感度(28%)明顯低于抗結(jié)核治療前(38%)，Donovan等[7]也在隨訪Xpert Ultra、Xpert基線研究中發(fā)現(xiàn)，治療3～4周后的TBM患者檢測陽性率明顯下降，與本研究結(jié)論一致。

2020年，Donovan等[7]使用Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值進行了一項前瞻性多中心隨機對照研究，發(fā)現(xiàn)在HIV陰性TBM(包括確診、很可能、可能TBM)患者中，Xpert Ultra 檢測的敏感度(38.9%)與Xpert(22.9%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.23)。但本研究兩者敏感度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)?？赡芘c該研究樣本量是按照Xpert Ultra檢測敏感度應(yīng)至少高于Xpert的25%設(shè)計的，當(dāng)Xpert Ultra檢測敏感度不足25%時，則不能得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)論[7]；而本研究的樣本量多于Donovan等的研究，且為同一樣本配對研究，更利于得到有效結(jié)果。

對62例CSF培養(yǎng)陰性的TBM患者而言，Xpert Ultra檢測CSF的陽性檢出率(38.7%)明顯高于Xpert(21.0%)，提示Xpert Ultra對CSF涂陰培陰TBM患者的診斷優(yōu)勢更為明顯。本研究納入的所有TBM患者的CSF涂片檢查均為陰性，且有81.6%(62例)的患者CSF的培養(yǎng)結(jié)果也為陰性，Xpert Ultra檢測CSF可使其中38.7%的患者獲得確診，較Xpert的確診率提高了17.7%，對避免神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生和改善患者預(yù)后有重要意義。

本研究還顯示，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養(yǎng)對HIV陰性TBM患者CSF的檢測特異度、陽性預(yù)測值均為100.0%，與其他研究一致[3-7]，也提示Xpert Ultra檢測CSF的陽性患者不會出現(xiàn)誤診。然而，本研究Xpert和Xpert Ultra的檢測敏感度分別為24.5%和44.3%，陰性預(yù)測值分別為36.0%和43.3%，提示當(dāng)兩種方法檢測結(jié)果為陰性時均不能除外TBM，仍需研發(fā)更有診斷價值的生物標(biāo)志物以協(xié)助診斷TBM。

據(jù)報道，如果沒有快速診斷和二線抗結(jié)核治療方案的合理應(yīng)用，利福平耐藥TBM的死亡率將接近100%[21]。本研究中，Xpert Ultra檢出2例利福平耐藥TBM患者，其中1例與表型藥敏試驗結(jié)果一致。由于Xpert技術(shù)的廣泛推廣，全球130個國家在2010—2016年間應(yīng)用Xpert技術(shù)對2300多萬例患者進行了檢測，使全球耐多藥結(jié)核病的檢出數(shù)量增加了3～8倍[22]。而Xpert Ultra運用了高分辨率熔解曲線技術(shù)，能更好地區(qū)分rpoB突變種類，可將“沉默突變”報告為“敏感”，且可靈敏地在混合感染中檢測出利福平耐藥情況，較Xpert技術(shù)進一步改進。然而，本研究應(yīng)用Xpert Ultra檢測利福平的耐藥結(jié)果并未體現(xiàn)出其優(yōu)于Xpert，這可能與研究樣本量太少有關(guān)。

本研究Xpert Ultra檢測陽性的47例TBM患者中，20例(42.6%)患者MTB負(fù)荷定量為“痕量”，這一結(jié)果主要通過新增添的IS6110和IS1081序列而獲得，但IS6110的拷貝數(shù)在不同譜系的分枝桿菌中存在較大差異[9]，是不同地區(qū)Xpert Ultra診斷TBM敏感度存在差異的原因之一，也是本次研究的意義之一。如L1譜系含有的IS6110數(shù)量較少，而L2、L3和L4譜系的分離株中則含有20多個IS6110拷貝[9]，其中L2譜系中的現(xiàn)代北京基因IS6110最豐富[23]；Chen等[24]報道，中國73.9%的肺結(jié)核屬于現(xiàn)代家系2，24.8%屬于家系4，0.92%屬于家系3，0.33%屬于家系1；而來自烏干達和越南的患者，則分別以家系4和家系2為主[5，7]。雖然“痕量”結(jié)果不能獲得rpoB基因耐藥突變情況，但這一結(jié)果足以指導(dǎo)臨床醫(yī)生及時開始抗結(jié)核藥物治療。

本研究有60例(56.6%)TBM患者在采集CSF前進行了抗結(jié)核藥物治療，導(dǎo)致本研究主要結(jié)論(Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的敏感度明顯高于Xpert和MGIT 960培養(yǎng))可能受到這部分患者的影響，不能更客觀、全面地分析抗結(jié)核藥物治療前Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值。但本研究也對采集CSF前未接受抗結(jié)核治療的患者進行了分層分析，發(fā)現(xiàn)Xpert Ultra對未接受抗結(jié)核治療的TBM患者檢測的敏感度明顯高于Xpert。

總之，Xpert Ultra檢測CSF診斷HIV陰性TBM的敏感度明顯高于Xpert和MGIT 960培養(yǎng)，尤其對MTB培養(yǎng)陰性的TBM患者的陽性檢出率明顯優(yōu)于Xpert，是目前診斷TBM最佳的病原學(xué)檢測方法，值得臨床推廣應(yīng)用。但其結(jié)果會受到抗結(jié)核藥物治療的影響，建議疑似TBM患者盡量在抗結(jié)核藥物治療前進行CSF的Xpert Ultra檢測。