宋世賓，仇文進(jìn)，侯雨男，魏入廷，陳寧益，徐卡婭，陳益民

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的腫瘤，腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力及對(duì)化療藥物的耐藥性是造成GBM不良預(yù)后的主要原因[1]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子基因家族(FOX家族)在膠質(zhì)瘤的侵襲、增殖及對(duì)替莫唑胺(TMZ)的耐藥中起到至關(guān)重要的作用，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box C1，F(xiàn)OXC1)是FOX家族中一個(gè)重要的成員，在包括GBM的多種惡性腫瘤進(jìn)展中作用尤為重要[2-4]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)OXC1促進(jìn)多種腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性，加快腫瘤的復(fù)發(fā)速度，不利于預(yù)后[5]，但FOXC1是否在GBM對(duì)TMZ化療耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用仍未被揭示，具體調(diào)控機(jī)制亟待深入探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑

U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)模式培養(yǎng)細(xì)胞保育中心(ATCC)，胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Gibco Introvagen公司，Trizol Regent試劑購(gòu)買于Ambion公司，兔抗人單克隆抗體FOXC1購(gòu)買于美國(guó)abcam公司，引物FOXC1購(gòu)買于上海生工生物工程有限公司，TMZ購(gòu)買于Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 組織樣本

選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2017年5月至2020 年11月期間收治的30例GBM患者參與本次研究，患者均進(jìn)行原發(fā)及復(fù)發(fā)兩次手術(shù)治療，收集兩次手術(shù)切除腫瘤組織：即原發(fā)GBM組織、復(fù)發(fā)GBM組織。選取的30例患者兩次手術(shù)組織病理均證實(shí)為GBM，患者中男18例，女12例，年齡27～75 歲，平均(55.8±8.4)歲。醫(yī)護(hù)人員已向所有參與本研究的患者詳細(xì)介紹本研究，并取得患者本人或患者授權(quán)委托人的同意，均簽署知情同意書。

所有入選患者均符合以下納入及排除標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均進(jìn)行兩次手術(shù)治療：診斷后初次手術(shù)治療、初次手術(shù)后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)TMZ化療方案治療后影像學(xué)證實(shí)復(fù)發(fā)且再次手術(shù)治療；②患者原發(fā)及復(fù)發(fā)組織均病理證實(shí)為GBM；③初次手術(shù)治療前未行放射或化學(xué)藥物等治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者在初次手術(shù)后進(jìn)行放射治療或靶向治療；②初次手術(shù)后未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)TMZ化療方案治療直至腫瘤復(fù)發(fā)；③同時(shí)患有顱內(nèi)其它類型腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞系U87-TR置于含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5%CO2,每隔3 d傳代1次。按照上海吉瑪公司和Invitrogen公司說(shuō)明書的方法在U87及U87-TR細(xì)胞中進(jìn)行FOXC1小干擾RNA和無(wú)意義序列的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 U87-TR培養(yǎng)

培養(yǎng)TMZ耐藥的GBM細(xì)胞系U87-TR：U87細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入TMZ處理24 h，接著TMZ的濃度不斷增加，直至到達(dá)EC50半最大效應(yīng)濃度，2周后取每上個(gè)濃度條件下存活的產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞置于增加濃度的TMZ中繼續(xù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)6個(gè)月，把這些最后篩選出的對(duì)TMZ耐藥的細(xì)胞置于含有TMZ(33μm)的完全培養(yǎng)基中以維持其耐藥性，獲得U87-TR(替莫唑胺耐藥U87)細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)

在提取的組織和細(xì)胞中使用TRIzol試劑提取總RNA，按照說(shuō)明書方法進(jìn)行qPCR反應(yīng),反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。分析PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)曲線，得到CT值，并按照2-ΔΔCt方法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。FOXC1引物序列：上游引物序列5’-AGAAACGCTAATGGACTCCACT-3’；下游引物序列5’-GTGCGGATCGTGTTCATGTT-3’。

1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)

提取組織和細(xì)胞中總蛋白，按照BCA法測(cè)定蛋白濃度并加入上樣緩沖液煮沸10 min，配制SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行蛋白上樣、電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗、顯影曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FOXC1在原發(fā)GBM組織與復(fù)發(fā)GBM組織表達(dá)水平中的比較

選取臨床診療過(guò)程中搜集的30例GBM患者兩次手術(shù)組織樣本：原發(fā)GBM組織及復(fù)發(fā)GBM組織，采用qPCR檢測(cè)組織中FOXC1的mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)FOXC1的mRNA表達(dá)水平在復(fù)發(fā)GBM組織中高于原發(fā)GBM組織(圖1A，P<0.01)；采用Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)GBM組織中FOXC1蛋白表達(dá)水平高于原發(fā)GBM組織(圖1B，P<0.05)。

圖1 qPCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXC1在原發(fā)GBM組織與復(fù)發(fā)GBM組織中的表達(dá)水平。A：qPCR發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)GBM組織中FOXC1的mRNA表達(dá)高于原發(fā)GBM組織,**P<0.01 (n=3)，***P<0.001 (n=3) ；B：Western Blot發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)GBM組織中FOXC1的蛋白表達(dá)高于原發(fā)GBM組織。

2.2 FOXC1在GBM中TMZ耐藥細(xì)胞系與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中FOXC1表達(dá)水平比較

在U87、U87-TR細(xì)胞中分別檢測(cè)FOXC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)GBM中TMZ耐藥細(xì)胞系U87-TR中FOXC1 mRNA(圖2A，P<0.01)及蛋白(圖2B，P<0.05)表達(dá)水平均上調(diào)。

2.3 U87-TR細(xì)胞下調(diào)FOXC1表達(dá)后TMZ誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡水平變化比較

FOXC1在GBM耐藥U87-TR細(xì)胞中表達(dá)水平較高,因此降低U87-TR細(xì)胞中FOXC1的表達(dá)后觀察細(xì)胞在TMZ誘導(dǎo)下的耐藥性。Western Blot顯示與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染FOXC1小干擾RNA后,U87-TR細(xì)胞中FOXC1蛋白表達(dá)明顯降低(圖3A， P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，U87-TR細(xì)胞轉(zhuǎn)染FOXC1小干擾RNA后TMZ誘導(dǎo)下腫瘤細(xì)胞凋亡水平明顯增加(圖3B，P<0.001)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方法取得了很大的進(jìn)展，比如手術(shù)治療、術(shù)后放化療在膠質(zhì)瘤診療中已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，但是膠質(zhì)瘤患者，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者的中位生存期和無(wú)進(jìn)展生存期依然不能讓人滿意[6]。即使在接受侵襲性切除和立體定向放療(radiotherapy,RT)后，GBM患者中位生存期也僅有12.1月，是人類腫瘤中生存預(yù)后最差的腫瘤之一。替莫唑胺(TMZ)是當(dāng)前整個(gè)國(guó)際上用于醫(yī)治膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療方案，作為膠質(zhì)瘤一線化療藥物應(yīng)用于臨床多年，其輔助治療使得GBM患者中位生存期延長(zhǎng)至14.6月，2年生存率從10.4%上升至26.5%[7]。盡管如此，由于GBM對(duì)TMZ耐藥性的形成，TMZ/RT-TMZ聯(lián)合治療難以起到遏制腫瘤生長(zhǎng)的作用，患者的5年生存率并無(wú)明顯提高[8]。追溯原因，腫瘤中耐藥基因的異常激活正是治療失敗的主因之一，嚴(yán)重遏制了該藥物的臨床效果，殘存下來(lái)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后及生活品質(zhì)[9]。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的患者能在TMZ的治療中獲得最大受益，但仍有40% MGMT低表達(dá)的患者對(duì)TMZ治療不敏感，這提示MGMT高表達(dá)并不是促成GBM對(duì)TMZ抵抗的唯一機(jī)制[10]，因此對(duì)GBM中TMZ耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)需要進(jìn)一步的提高。

圖2 qPCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXC1在GBM中TMZ耐藥細(xì)胞系與GBM細(xì)胞系中的表達(dá)水平。A：qPCR發(fā)現(xiàn)U87-TR細(xì)胞中FOXC1的mRNA表達(dá)高于U87細(xì)胞,**P<0.01 (n=3) ；B：Western Blot發(fā)現(xiàn)U87-TR細(xì)胞中FOXC1的蛋白表達(dá)高于U87細(xì)胞。

圖3 U87-TR細(xì)胞中下調(diào)FOXC1后TMZ誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡水平變化。A：Western Blot發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組FOXC1的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組在TMZ誘導(dǎo)下腫瘤細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組明顯增加，***P<0.001 (n=3)。

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族(Forkhead box family,FOX家族)根據(jù)基礎(chǔ)序列、同源性、結(jié)構(gòu)和親和力分為數(shù)個(gè)家族，每個(gè)家族均有成員在腫瘤的進(jìn)展中起到重要作用[11-12]。叉頭框C1(FOXC1)是FOX家族眾多成員中比較重要的成員之一，其在胚胎發(fā)育、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面具有重要的作用，其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和引起患者較差預(yù)后方面密切相關(guān)[13-14]。FOXC1與多種信號(hào)通路組成惡性的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在許多腫瘤中已經(jīng)被報(bào)道存在異常，研究表明，F(xiàn)OXC1促進(jìn)結(jié)直腸癌[15]、乳腺癌[16]、前列腺癌[17]等腫瘤進(jìn)展，造成患者不良預(yù)后。此外一些研究表明，F(xiàn)OXC1參與了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，F(xiàn)OXC1增強(qiáng)了結(jié)直腸腫瘤對(duì)奧沙利鉑及伊立替康的耐藥性[3]；下調(diào)FOXC1逆轉(zhuǎn)了宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[18]；抑制FOXC1表達(dá)通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性凋亡通路提高了肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性[19]。研究報(bào)道FOXC1 mRNA與蛋白水平在GBM細(xì)胞系及組織樣本中表達(dá)明顯升高，GBM細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)上調(diào)FOXC1能夠介導(dǎo)β-catenin增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖能力[20-21]。但到目前為止，鮮有FOXC1在膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ化療耐藥中是否發(fā)揮作用的研究，因FOXC1在其它一些腫瘤中對(duì)化療藥物耐藥性的影響，我們提出疑問(wèn)：FOXC1是否在GBM對(duì)TMZ化療耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用？ 通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1表達(dá)水平在復(fù)發(fā)GBM組織高于原發(fā)GBM組織，提示FOXC1表達(dá)水平可能與GBM對(duì)TMZ耐藥性有關(guān)，隨即我們通過(guò)培養(yǎng)GBM的TMZ耐藥細(xì)胞，檢測(cè)到FOXC1表達(dá)水平在GBM的TMZ耐藥細(xì)胞中高于普通膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，TMZ誘導(dǎo)下GBM的TMZ耐藥細(xì)胞中沉默F(xiàn)OXC1表達(dá)后腫瘤細(xì)胞凋亡水平增加，增強(qiáng)了其對(duì)TMZ的敏感性。

綜上所述，F(xiàn)OXC1表達(dá)水平與GBM對(duì)TMZ耐藥性有關(guān)，沉默F(xiàn)OXC1表達(dá)后促進(jìn)GBM對(duì)TMZ的敏感性，該研究結(jié)果為日后阻斷GBM對(duì)TMZ的耐藥性提供了一個(gè)新的潛在方法。