符婕 王紅

(佳木斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 佳木斯 154002)

宮頸癌是世界女性死亡的第四大常見原因〔1〕。目前，臨床早期宮頸癌的主要治療方法是盆腔手術(shù)，另外，對于晚期或復(fù)發(fā)性癌癥患者化療是輔助治療的常用方法。然而，多種化療藥物有副作用，如神經(jīng)毒性、耐藥性等〔2〕，導(dǎo)致其應(yīng)用的局限性。阿魏酸(FA)的化學(xué)名稱為4羥基3甲氧基肉桂酸，是一種廣泛存在于植物中的酚酸，在中藥研究中應(yīng)用較多。藥理藥效方面的研究發(fā)現(xiàn)FA及衍生物有較好的藥理作用和生物活性，且毒性較低〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn)FA具有抗腫瘤活性〔5,6〕，另外還有研究發(fā)現(xiàn)FA可通過增加自然免疫防御減少癌癥的化療和放療的副作用通〔7〕，但抗腫瘤的確切機制還沒有闡明，且未見FA對宮頸癌治療的研究。微小核糖核酸(miRNA)是在調(diào)節(jié)基因表達過程中發(fā)揮作用的一類非編碼的內(nèi)源RNA。一方面miRNAs可作為癌基因下調(diào)抑癌基因的表達促進腫瘤細胞的生長，另一方面又可作為抑癌基因在轉(zhuǎn)錄后與原癌基因結(jié)合,抑制其表達,從而抑制腫瘤的生長〔8〕。研究表明,miR-34家族是p53直接的轉(zhuǎn)錄靶分子,參與了包括細胞周期阻滯和細胞凋亡等過程的調(diào)節(jié)〔9〕。研究表明miRNA參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展進程〔10〕，其中miR-34a在宮頸癌組織中表達下調(diào)〔11〕。miRNAs的發(fā)現(xiàn)為腫瘤治療提供了新的治療策略和靶點。用生物信息學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-34a可與B細胞淋巴瘤(Bcl)-2的結(jié)合抑制其表達。為此，本研究建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型，探討FA能否促進miR-34a表達，并抑制裸鼠移植瘤細胞的增殖。

1 材料與方法

1.1動物與細胞 具有正常免疫功能的20只雄性Wistar大鼠，體重165～195 g購買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,在佳木斯大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，大鼠養(yǎng)殖過程中保持環(huán)境溫度為22～24℃，濕度為50%，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食。Hela細胞系由佳木斯大學(xué)生物學(xué)教研室提供。

1.2藥品與試劑 miR34a引物由上海生物工程有限公司合成；u6引物及miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；RNAeasyTM動物小RNA抽提試劑盒、電化學(xué)發(fā)光液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；免抗Bcl-2(affinity)、鼠抗β-actin、貓抗鼠免疫球蛋白(Ig)G、貓抗免IgG購自武漢博士德生物有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(Solarbio)、RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO/Invitrogen)、HF購自上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均由實驗室提供。

1.3細胞培養(yǎng)及人宮頸癌Hela細胞裸鼠移植瘤模型建立 將Hela細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至 5×107/ml作為接種液。按0.2 ml/只接種量接種于大鼠右腋窩皮下。接種完成后，無菌條件下飼養(yǎng)，每日觀察小鼠瘤體積，待腫瘤直徑≥5 mm時定義為造模成功。所有大鼠均在接種后5 d內(nèi)成瘤，成瘤率為100%，成瘤后每隔5 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑，最后繪制腫瘤體積曲線。

1.4實驗動物分組及給藥方法 將 20 只造模成功的小鼠隨機分為注射生理鹽水組(模型組)、高劑量FA(HFA)組、中劑量FA(MFA)組和低劑量FA(LFA)組各5只。依據(jù)文獻〔12〕調(diào)整給藥劑量，HFA組給藥劑量為100 mg/kg，MFA組給藥劑量為50 mg/kg，LFA組給藥劑量為25 mg/kg。腹腔注射給藥，每天1次，共28 d。

1.5移植瘤的處理 末次給藥后 24 h，采用斷髓法處死各組小鼠，取皮下腫瘤組織，稱取瘤重，計算腫瘤體積和抑瘤率。抑瘤率=(對照組平均質(zhì)量-實驗組平均質(zhì)量)/對照組平均質(zhì)量×100%；腫瘤體積=長徑×短徑2/2。稱重后，將腫瘤組織保存于-80℃冰箱待檢。

1.6熒光定量PCR檢測移植瘤組織中miR34a的表達 將備用的移植瘤組織平均分成兩份，取其中一份組織剪碎，提取總RNA(按試劑說明書操作)，分光光度計測定RNA濃度，用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再使用熒光定量PCR試劑盒，ABI7300PCR儀進行 PCR 擴增miR-34a,miR-34a引物為：正向：5′-ATACCGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTT-3′；反向：5′-ATACCGCTCGAGCCTGTGCCTTTTTCCTTCC-3′,U6 為 內(nèi) 參，擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 10 s、退火/延伸60℃ 30 s、循環(huán)40次。采用2-△△Ct法計算miR-34a的表達情況。

1.7Western印跡檢測Bcl-2、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3和細胞色素(cytochrome)-C蛋白的表達 取出凍存的移植瘤組織放入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液，用組織研磨機將瘤組織碾碎致勻漿狀，將勻漿放入4℃冰箱靜止30 min，離心提取蛋白。用BCA試劑盒測總蛋白的濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，恢復(fù)至室溫。上樣(30 μg)于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(15% 分離膠,5% 壓縮膠)，電泳至溴酚藍離膠板最下端1 cm處停止。根據(jù)蛋白marker和目的蛋白分子量來選擇切膠位置。然后進行電轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)模完畢用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。4℃一抗孵育過夜。將膜置于搖床上，用TBST洗滌3次，每次5 min。二抗室溫孵育50 min〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶1 000〕，用TBST洗滌3次，每次5 min。最后電化學(xué)發(fā)光曝光顯影，采用相對灰度值(目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值)表示蛋白的表達情況。使用Tanon GLS軟件進行條帶強度檢測和定量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FA對移植瘤組織生長的影響 移植瘤接種初期，各組腫瘤體積均逐漸加大，在治療過程中，各治療組腫瘤生長速度隨著FA濃度的增加逐漸減慢,14 d后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。治療結(jié)束時，與模型組相比，隨著FA濃度的增加治療組腫瘤質(zhì)量顯著下降(F=1 443.69，P<0.001)，治療組腫瘤體積也顯著減小(F=228.55，P<0.001)，均有劑量依賴效應(yīng)。見表2。

表1 各組裸鼠皮下移植瘤體積生長及生長抑制比較

2.2FA對移植瘤組織中miR-34a表達的影響 miR-34a表達量隨著FA給藥濃度的增加而顯著增高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

2.3FA對移植瘤組織中Bcl-2、caspase-3和cytochrome-C表達的影響 與模型組比較，F(xiàn)A治療組的caspase-3和cytochrome-C蛋白表達量隨著FA給藥濃度的增高而顯著增高(F=159.365，F(xiàn)=1 021.455,P<0.001)；而Bcl-2蛋白表達量隨著FA給藥濃度的增高而顯著降低(F=161.157,P<0.001)。Bcl-2蛋白表達量變化趨勢與miR-34a正好相反。見表2，圖3。

表2 FA對移植瘤組織中miR-34a及Bcl-2、caspase-3、cytochrome-C蛋白表達的影響

圖3 FA對移植瘤組織中Bcl-2、caspase-3和cytochrome-C蛋白及miR-34a表達的影響

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示，大鼠宮頸癌Hela細胞裸鼠移植瘤經(jīng)不同濃度FA處理后，生長增殖明顯受抑，瘤體減小，細胞凋亡增加，說明FA能夠有效抑制宮頸癌移植瘤的生長，其作用機制可能與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

miR-34 家族是近年來備受關(guān)注的 miRNA 之一。目前研究已經(jīng)證實，miR-34a通過多種下游靶分子參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)特性，如異常增殖與凋亡減弱等。余瑛等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)δ-三烯生育酚可上調(diào)Hela宮頸癌細胞中的miR-34a表達，miR-34a可下調(diào)細胞周期蛋白(CCN)D1表達，進而抑制細胞增殖。Bcl-2是癌基因，定位于細胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜上，可從細胞質(zhì)移位到線粒體外膜上阻止凋亡形成因子如cytochrome-C等從線粒體釋放出來，參與細胞內(nèi)源性凋亡途徑的起始階段〔14〕，在多種腫瘤中Bcl-2高表達，并且Bcl-2是抗凋亡蛋白，可以阻止細胞凋亡〔15〕。Bcl-2是miR-34a下游靶基因之一，miR-34a與Bcl-2的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制其表達進而促進細胞凋亡。本研究說明FA可誘發(fā)miR-34a表達上調(diào)，進而通過抑制其下游靶基因抗凋亡基因 Bcl-2的表達，激活caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。由此推測FA可能通過促進miR-34a 表達誘導(dǎo)移植瘤細胞凋亡，從而抑制皮下宮頸癌移植瘤的增值。這一結(jié)果與王傳卓等〔16〕在miR-34a對結(jié)腸癌SW480皮下移植瘤生長影響的研究結(jié)果相同，但FA與miR-34a之間的確切交互關(guān)系尚需進一步研究。