李豪 姬發(fā)祥 徐曉寧 馬金華 沈存芳 李進章 王麗娟

(青海大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810000)

肝癌是臨床常見惡性腫瘤且病死率極高，其病理基礎較為復雜，目前臨床主要采用根治術(shù)治療肝癌但患者術(shù)后易復發(fā)〔1〕。既往研究顯示肝癌靶向藥物治療成為主流，基因及蛋白表達異常與肝癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移等惡性特征有關〔2〕。因此積極研究基因及蛋白在肝癌發(fā)生及發(fā)展中的作用可為指導肝癌精準治療提供參考。微小RNA-645(miR-645)在頭鱗癌組織中表達上調(diào)并與頭鱗癌的轉(zhuǎn)移及預后密切相關，上調(diào)miR-645能夠增強頭鱗癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及單克隆形成等能力〔3〕。miR-645在結(jié)腸癌及肝癌組織中表達上調(diào)，抑制miR-645表達能抑制結(jié)腸癌細胞的增殖〔4，5〕。通過生物學信息軟件預測內(nèi)皮素(EDN)3是miR-645的靶基因，而EDN3基因在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中表達水平明顯降低并可能作為腫瘤靶向治療的潛在靶點〔6～9〕。本研究旨在探討miR-645在肝癌細胞中的表達并采用基因干擾技術(shù)抑制miR-645表達，分析miR-645表達量改變對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，驗證miR-645與EDN3的靶向作用關系，旨在為肝癌靶向治療提供新作用靶點。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402與正常肝細胞株L02均購自上海生命科學院細胞庫。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；miR-645 mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-645抑制劑(anti-miR-645)、anti-miR-NC均購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；EDN3 siRNA(si-EDN3)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國Invitrogen公司；EDN3過表達質(zhì)粒(pcDNA-EDN3)與對照質(zhì)粒(pcDNA)均購自北京合生基因科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；蛋白裂解液與二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；鼠抗人EDN3單克隆抗體購自武漢戴安生物技術(shù)有限公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單抗均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強型化學發(fā)光試劑(ECL)購自美國Bio-Rad公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購自日本Toyobo公司。

1.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 肝癌細胞與正常肝細胞株均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長匯合達到60%～70%時進行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后制備細胞懸浮液接種至6孔細胞培養(yǎng)板，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞生長融合至30%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基，分別用anti-miR-NC、anti-miR-645、miR-NC、miR-645 mimic及pcDNA-EDN3、pcDNA轉(zhuǎn)染入肝癌細胞，實驗分為anti-miR-NC組、anti-miR-645、miR-NC組、miR-645組、pcDNA-EDN3組、pcDNA組。為了驗證EDN3對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，分別將EDN3 siRNA、si-NC分別轉(zhuǎn)染入anti-miR-645組肝癌細胞，分別為anti-miR-645+si-EDN3組、anti-miR-645+si-NC組。轉(zhuǎn)染后12 h更換完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將轉(zhuǎn)染成功的細胞用于實驗。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-645及EDN3 mRNA表達水平 檢測不同肝癌細胞株、正常肝細胞株及轉(zhuǎn)染前后各組細胞中miR-645、EDN3 mRNA相對表達量，Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，配置qRT-PCR反應體系，qRT-PCR條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。采用比較閾值(Ct)法定量分析數(shù)據(jù)，miR-645以U6為內(nèi)參基因，EDN3以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.4Western印跡檢測EDN3、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達 收集各組細胞后加入蛋白裂解液，12 000 r/min離心10 min提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白(蛋白上樣量40 μg)，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，BSA封閉1 h后置于4℃孵育過夜，分別加入各蛋白一抗，EDN3蛋白稀釋比為1∶200，CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白稀釋比均為1∶500，TBST洗滌，分別加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯色，X線膠片曝光后用蒸餾水清洗，利用凝膠分析系統(tǒng)分析各條帶吸光度值。

1.5熒光素酶報告基因檢測miR-372-3p靶基因 將熒光素酶報告載體WT-EDN3、MUT-EDN3分別與miR-645 mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測HepG2細胞相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值)。

1.6MTT檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期HepG2細胞，胰蛋白酶消化(濃度5×104個細胞/ml)，以每孔體積100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組均設置3個復孔，放置在溫度37℃、相對濕度95%、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，按照“1.2”進行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h加入MTT溶液(體積為20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后分別在每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，利用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.7Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(稀釋比1∶8)，將100 μl稀釋液鋪于Transwell小室底部的上室面，同時將各組轉(zhuǎn)染HepG2細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后采用DMEM培養(yǎng)基重懸(2×105個/ml)，取200 μl細胞懸浮液置于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μl加入Transwell小室下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用多聚甲醛固定，20 min后使用結(jié)晶紫溶液染色，15 min后用棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)面細胞，置于顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野計算侵襲細胞個數(shù)。細胞遷移實驗中無需在Transwell小室底部的上室面鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同細胞侵襲實驗，實驗結(jié)束后置于顯微鏡下觀察遷移細胞個數(shù)。實驗均設置3次生物學重復。

1.8統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細胞和正常肝細胞L02中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-645在不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細胞中表達水平明顯高于正常肝細胞L02(P<0.05)，而EDN3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡檢測結(jié)果顯示，不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細胞中EDN3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。肝癌HepG2細胞中miR-645表達水平最高，EDN3 mRNA及蛋白表達最低，因此后續(xù)實驗中主要以HepG2細胞為研究材料。

表1 miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細胞和正常肝細胞L02中的表達

圖1 EDN3蛋白表達

2.2miR-645靶向調(diào)控EDN3的表達 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-645 mimic可明顯抑制WT-EDN3的熒光素酶活性(P<0.05)，但miR-645 mimic對MUT-EDN3的熒光素酶無明顯抑制作用(P>0.05)，見圖2、表2。Western印跡法結(jié)果顯示，miR-645組HepG2細胞中EDN3蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-645組顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見表3，圖3。

圖2 EDN3的3′UTR中含有與miR-645互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 miR-645調(diào)控EDN3蛋白的表達

1～4：miR-NC組、miR-645組、anti-miR-NC組、anti-miR-645組圖3 EDN3蛋白表達

2.3干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響 干擾miR-645表達后，采用qRT-PCR法驗證沉默效果，結(jié)果顯示anti-miR-645組HepG2細胞中miR-645表達水平較anti-miR-NC組明顯降低(P<0.05)，提示沉默效果良好可用于后續(xù)實驗。MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后anti-miR-645組HepG2細胞增殖活性明顯低于anti-miR-NC組(P<0.05)。下調(diào)miR-645表達后HepG2細胞遷移及侵襲細胞數(shù)目顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖4，圖5，表4。anti-miR-645組HepG2細胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，而p21蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見表5。

表5 干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖4 Western印跡檢測相關蛋白表達

圖5 HepG2的遷移、侵襲(×200)

表4 干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響

2.4EDN3過表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響 pcDNA-EDN3組HepG2細胞中EDN3蛋白表達明顯高于pcDNA組(P<0.05)。pcDNA-EDN3組HepG2細胞OD值(48、72 h)、遷移細胞及侵襲細胞數(shù)目均顯著低于pcDNA組(P<0.05)。pcDNA-EDN3組HepG2細胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達顯著低于pcDNA組(P<0.05)，而p21蛋白表達顯著高于pcDNA組(P<0.05)，見圖6、表6、表7。

表6 EDN3過表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響

表7 EDN3過表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖6 EDN3和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.5抑制EDN3表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的作用 相對于anti-miR-645+si-NC組，抑制EDN3表達后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HepG2細胞OD值(48、72 h)、遷移細胞及侵襲細胞數(shù)目增加(P<0.05)，p21蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖7、表8、表9。

表8 抑制EDN3表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的作用

表9 抑制EDN3表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達的作用

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-645組、anti-miR-645+si-NC組、anti-miR-645+si-EDN3組圖7 EDN3蛋白表達

3 討 論

肝癌患者復發(fā)率極高，細胞侵襲性強等病理特征造成臨床治療困難，由于肝癌發(fā)病隱匿導致患者確診時已處于中晚期〔10〕。miRNA表達異?？赏ㄟ^調(diào)控靶基因表達進而影響肝癌發(fā)生及發(fā)展，研究表明部分miRNA可提高肝癌診斷敏感性及特異性，還可為肝癌治療提供作用靶點〔11〕。因而探尋新型miRNA對肝癌細胞遷移及侵襲的影響有助于提高臨床靶向治療效果。

miR-645可通過調(diào)控下游靶基因表達進而參與乳腺癌細胞侵襲等生物學過程〔12〕。Chen等〔13〕研究表明miR-645可通過靶向GK5促進腎透明細胞癌的細胞轉(zhuǎn)移和增殖。Feng等〔14〕研究表明miR-645還可作為致癌基因促進胃癌發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果說明miR-645可能參與肝癌發(fā)生過程。提示miR-645可能作為臨床早期診斷肝癌的重要分子標志物。Wang等〔15〕研究表明長鏈非編碼RNA LINC00161可通過調(diào)節(jié)miR-645-IFIT2軸使骨肉瘤細胞對順鉑誘導的細胞凋亡敏感。Cai等〔16〕研究表明抑制miR-645表達可通過靶向DCDC2抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究采用基因干擾技術(shù)抑制miR-645表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾miR-645表達后HepG2細胞增殖活性、遷移及侵襲細胞數(shù)目均明顯降低。采用Western blot法檢測細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達，結(jié)果表明MMP-2、MMP-9激活后可通過促進惡性腫瘤血管生成進而促進腫瘤細胞增殖及遷移，CyclinD1蛋白表達升高可促進惡性腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，p21可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶激活進而抑制細胞增殖〔17〕。提示抑制miR-645表達可通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達并促進p21蛋白表達進而降低肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。但關于miR-645如何調(diào)控肝癌發(fā)生及發(fā)展相關信號通路仍需進一步研究證實。

EDN3在乳腺癌、結(jié)直腸癌及宮頸鱗癌等癌組織或細胞中均呈低表達并可抑制癌細胞遷移及侵襲能力〔18～20〕。本研究結(jié)果顯示不同肝癌細胞中EDN3表達水平均明顯降低，與上述研究結(jié)果相似。提示EDN3表達水平降低可促進肝癌發(fā)生。通過構(gòu)建EDN3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝癌細胞，結(jié)果提示上調(diào)EDN3表達可抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CEDN3是miR-645的靶基因，miR-645可負向調(diào)控EDN3表達。為了進一步驗證miR-645是通過負向調(diào)控EDN3蛋白表達而發(fā)揮作用，本研究將EDN3 siRNA及si-NC分別與anti-miR-645共轉(zhuǎn)染入肝癌細胞，結(jié)果提示miR-645可通過調(diào)控EDN3表達進而促進肝癌細胞增殖、遷移及侵襲。