趙杰 王科 龐輝 李想 伍果 李寶嘉 龍賢 蒙浩

(廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021)

心腦血管疾病的發(fā)生主要是由于血凝和抗凝的平衡被打破，血管內(nèi)血栓異常形成引起。傳統(tǒng)的抗凝溶栓藥比較昂貴，且毒副作用較大。近年來(lái)，來(lái)自海洋生物和微生物的第四代抗凝溶栓藥物引起人們的關(guān)注，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)把它們分離出來(lái)，開(kāi)發(fā)新型高效、低毒、特異性高、副作用小的天然溶栓藥物成為研究的熱點(diǎn)，其代表藥物有蚓激酶、葡激酶、水蛭素、納豆激酶等。螺旋藻是一種原核生物，屬于藍(lán)藻門(mén)，藍(lán)藻綱，顫藻科，具有寶貴的保健和藥用價(jià)值。經(jīng)篩選特殊菌種對(duì)它發(fā)酵后獲得了一種含蛋白激酶(稱為螺旋藻激酶，SPK)的產(chǎn)物，前期的實(shí)驗(yàn)研究證明SPK能使動(dòng)物血液凝固時(shí)間延長(zhǎng)，并有體內(nèi)外的溶栓作用，還可使內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型組織型纖溶酶原激活物m-RNA的表達(dá)增加，抑制纖溶酶原激活物抑制物m-RNA的表達(dá)〔1～3〕。本文研究SPK對(duì)體內(nèi)內(nèi)皮損傷模型大鼠生理性血栓素(TX)A2、6-酮-前列腺(6-Keto-PG)F1a的影響，探討其通過(guò)血小板功能影響血液凝固的機(jī)制，探討其心血管保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠50只，雌雄不限，體重(200±200)g，清潔級(jí)，購(gòu)買(mǎi)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK桂2014-003號(hào)。飼養(yǎng)室溫度控制在20～25℃。

1.2原料、藥品、試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 SPK自行提取、純化，SPK發(fā)酵粉原料由廣西北海市康福保健食品有限公司提供；FeCl3、烏拉坦，BBI公司；硫酸銨分析純，上海生工生物工程有限公司；抗凝劑，上海滬峰生物科技有限公司。大鼠TXB2放射免疫試劑盒和6-keto-PGF1a放射免疫試劑盒，Cusabio生物科技公司。GradiFrac P-50型蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)，Pharmacia Biotech公司；8000-14000 MD25型透析袋，Solarbio公司；DFM-96型放射免疫γ計(jì)數(shù)器，合肥眾成機(jī)電技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3SPK的提取與純化 SPK發(fā)酵干粉用蒸餾水浸泡，充分混勻、攪拌，靜置8 h后，低溫離心收集上清液，然后進(jìn)行硫酸銨分級(jí)鹽析，45%硫酸銨鹽析后收集上清、再加入硫酸銨使終濃度達(dá)75%后收集沉淀，經(jīng)透析，凍干，凝膠過(guò)濾層析后得到SPK粉保存?zhèn)溆?，純化后的酶比? 631.1 IU/mg，活力回收率42.3%，純化倍數(shù)6.1倍〔4〕。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為五組，每組10只：正常對(duì)照組(2 ml生理鹽水+40 μl生理鹽水)、模型組(40 μl FeCl3+2 ml生理鹽水+40 ml生理鹽水)、SPK低劑量組 (40 μl FeCl3+2 ml 1 mg/100 g SPK)、SPK中劑量組(40 μl FeCl3+2 ml 10 mg/100 g SPK)、SPK高劑量組 (40 μl FeCl3+2 ml 20 mg/100 g SPK)。造模前8 h，正常對(duì)照組、模型組給予無(wú)菌生理鹽水各2 ml，SPK低、中、高劑量分別股靜脈按劑量給藥一次。隨后大鼠腹腔麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈2～3 cm，正常對(duì)照組在頸動(dòng)脈上方濕敷吸有40 μl生理鹽水的濾紙，其他各組在相同位置濕敷吸有40 μl FeCl3溶液的濾紙。60 min后開(kāi)腹從腹主動(dòng)脈取血，按抗凝劑與血量的比例為1∶9來(lái)加入抗凝劑混勻，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取血漿置-20℃冷凍保存待用〔4，5〕。

1.5放射免疫法檢測(cè)TXB2、6-keto-PGF1a的含量 將TXB2試劑加入受檢血漿中，TXB2和加入的125I-TXB2抗體產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)。TXB2含量與125I-TXB2與抗體結(jié)合量呈一定的函數(shù)關(guān)系，測(cè)定測(cè)量放射性強(qiáng)度來(lái)計(jì)算相應(yīng)結(jié)合率，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算TXB2含量，以推斷TXA2含量。將6-keto-PGF1a 試劑加入受檢血漿中，6-Keto-PGF1a與試劑的125I-Keto-PGF1a抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)。非標(biāo)記I-6-Keto-PGF1a含量與125I-6-Keto-PGF1a與抗體復(fù)合物的比例呈反比。測(cè)定沉淀物的放射性計(jì)數(shù)，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算6-Keto-PGF1a含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，方差齊使用LSD方法；方差不齊使用Games-Howell方法。

2 結(jié) 果

與正常對(duì)照組相比，模型組TXB2和6-Keto-PGF1a含量顯著升高，TXB2/6-Keto-PGF1a比例顯著升高(P<0.01)，SPK各劑量組與模型組對(duì)比，TXB2和6-Keto-PGF1a含量、TXB2/6-Keto-PGF1a比例顯著下降。見(jiàn)表1。

表1 各組血液TXB2、6-Keto-PGF1a含量比較

3 討 論

血栓是血液中凝血因子激活形成纖維蛋白的過(guò)程。在生理狀態(tài)下，血液中有促凝和抗凝因素影響著凝血過(guò)程，血小板本身參與了凝血的過(guò)程，同時(shí)通過(guò)釋放一些因子影響血凝、抗凝和纖溶過(guò)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)表面單層細(xì)胞屏障，具有抗凝和促凝雙重特性，一方面可以將血液中凝血因子、血小板與內(nèi)皮下膠原纖維隔離，防止內(nèi)源性凝血反應(yīng)的激活；另一方面通過(guò)合成能抑制血小板黏附聚集的前列環(huán)素(PG)來(lái)抑制凝血的過(guò)程〔6〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血栓性疾病發(fā)生的啟動(dòng)因素，尋求有效的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)劑，抑制血小板活化來(lái)防治心腦血管疾病，已成為國(guó)內(nèi)外抗血栓藥物研究的熱點(diǎn)之一。

TXA2和PGI2均為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，TXA2可以使血小板內(nèi)游離Ca2+增多，cAMP減少，引起血小板釋放內(nèi)源性ADP，繼而導(dǎo)致血管收縮和血小板聚集。TXA2性質(zhì)極不穩(wěn)定，但其代謝產(chǎn)物TXB2相當(dāng)穩(wěn)定。 PGI2與TXA2的作用正好相反，它具有強(qiáng)烈的舒張血管和抑制血小板聚集的作用。PGI2半衰期也很短，很快轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的6-Keto-PGF1a。正常生理狀態(tài)下，血漿或組織里的PGI2和TXA2濃度處于相對(duì)平衡狀態(tài)，保持血管通暢并維持適當(dāng)?shù)木o張性。當(dāng)血管損傷時(shí)，血小板和內(nèi)皮下膠原纖維接觸，促使TXA2生成增多而促進(jìn)血小板聚集，而血管壁則通過(guò)促進(jìn)花生四烯酸合成PGI2來(lái)對(duì)抗TXA2的作用以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。如果TXA2與PGI2的平衡被打破則引起血栓形成〔4～6〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TXA2和PGI2系統(tǒng)紊亂，促進(jìn)了血栓的形成。SPK明顯改善了TXA2分泌，從而影響TXA2/PGI2比值來(lái)增加抗凝活性。因此，SPK可以保護(hù)受損傷刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，發(fā)揮抗血栓形成和保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。