薛乃銘 柴夢鈺 楊萬山 周憲春

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，吉林 延吉 133002；2病理生理學(xué)教研室；3延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科)

卵巢癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，對女性生命造成嚴(yán)重威脅〔1,2〕。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，卵巢癌早期難以發(fā)現(xiàn)〔3,4〕，其病死率在婦科腫瘤中居首位?，F(xiàn)階段暫無防治卵巢癌有效的治療方式與治療藥物。白花前胡乙素是從白花前胡根中提取的一種角型吡喃香豆素成分，具有降氣化痰，散風(fēng)清熱的作用〔5～7〕。近年研究表明，白花前胡乙素是膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)1c的抑制劑，能夠通過調(diào)節(jié)脂代謝發(fā)揮降血脂、預(yù)防心血管疾病及抗腫瘤作用〔8〕。脂代謝在腫瘤細(xì)胞的能量存儲、細(xì)胞增殖及重要信號分子合成等方面起到重要作用。調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞物質(zhì)能量代謝成為預(yù)防和治療腫瘤的新途徑〔9,10〕。Ahmed等〔11〕研究表明卵巢癌患者SREBP1c高表達(dá)，提示抑制SREBP1c調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞脂代謝過程，為防治卵巢癌提供了新思路。目前關(guān)于白花前胡乙素防治卵巢癌的作用研究報道較少，對于其發(fā)揮藥效的作用機(jī)制研究較少，本實驗研究白花前胡乙素對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制效果。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3株來自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2藥品與試劑 白花前胡乙素購自成都格利普生物科技有限公司，其純度在98%以上；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青-鏈霉素等實驗原料均購自美國Gibco公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所；c-Myc、G1/S-特異性周期蛋白(Cyclin)D1、SREBP1c、脂肪酸合成酶(FASN)mRNA、β-actin上下游引物、探針等均由InvitrogenTM公司負(fù)責(zé)設(shè)計合成；從DBI公司選購熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑；SREBP1c (Ab28481)兔單克隆抗體購自美國Abcam公司；FASN兔單克隆抗體、β-actin 兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG二抗均購自美國CST公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、細(xì)胞蛋白提取試劑、RNA提取試劑均購自美國Thermo Fisher Scientifu公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠快速制備試劑盒購自美國EpiZyme Scientifu公司；超純水，剩余試劑均使用實驗室常用規(guī)格試劑。

1.1.3實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱、xMark酶標(biāo)儀、電泳儀、全能蛋白轉(zhuǎn)膜儀、TC20細(xì)胞計數(shù)器、PCR實時定量儀均購自美國伯樂公司；TDL-50B離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；分析天平(FB1035)購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；G:BOX化學(xué)成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司；CKX31倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Vortex Mixer渦旋儀、hh-s24恒溫水浴鍋均購自太創(chuàng)始華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)細(xì)胞 由10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素共同組成DMEM高糖培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件為恒溫37℃、CO2濃度5%，同時對細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀測與記錄。

1.2.2藥物配置 配置白花前胡乙素溶液：選取白花前胡乙素對照品42.6 mg，另選取二甲基亞砜(DMSO)10 ml，將白花前胡乙素對照品溶于DMSO，由此配置獲得濃度為100 mol/L的白花前胡乙素對照品母液，儲存溫度為-20℃。需使用時，可以結(jié)合實際使用需求抽取白花前胡乙素對照品母液隨后稀釋至10 mol/L，最后將稀釋后的溶液通過0.22 μm微孔濾膜便可使用。

1.2.3白花前胡乙素濃度篩選 提取適量處于生長期的細(xì)胞，在胰酶消化的作用下形成細(xì)胞懸液同時用細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)，5 000個/孔，每孔體積100 μl，鋪于96孔板。設(shè)有空白組、對照組、濃度不同的藥物組，每組配備復(fù)孔數(shù)量為6個。藥物組需要依次通過濃度為10、20、40、60、80、100 mol/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，空白組與對照組的培養(yǎng)基體積相同。48 h后，在每個孔中加入10 μl CCK-8試劑，后續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)對細(xì)胞存活率進(jìn)行計算。重復(fù)上述步驟3次，最終獲得可靠結(jié)論。細(xì)胞存活率(%) =(A藥物組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.2.4分組及給藥 取對數(shù)生長期卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，設(shè)對照組和白花前胡乙素給藥組(20、40、60 μmol/L)，不同劑量的白花前胡乙素給藥作用24 h后，收集細(xì)胞用于檢測分析，重復(fù)實驗3次。

1.2.5白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中遷移的影響 10 μl槍頭在每孔單層細(xì)胞上迅速輕柔地劃痕，洗去懸浮細(xì)胞，然后給予不同濃度白花前胡乙素作用24 h后觀察各組細(xì)胞劃痕修復(fù)率。

1.2.6白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表達(dá)水平的影響 不同濃度白花前胡乙素在藥物作用下對細(xì)胞進(jìn)行收集。在RNA提取試劑盒的作用下對卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3中的RNA進(jìn)行提取，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下實現(xiàn)RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨即運用RT-qPCR對c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA的實際表達(dá)效果進(jìn)行檢測。當(dāng)反應(yīng)體系為10 μl的情況下，PCR擴(kuò)增條件為：①溫度為95℃時預(yù)變性為2 min；②在95℃條件下變性10 s，62℃溫度條件下退火時間30 s；③72℃溫度條件下延伸時長15 s，循環(huán)共計40個，β-actin作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算對相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行表示，表1所示為引物序列。

表1 引物序列

1.2.7白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中SREBP1c/FASN信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 濃度不同的白花前胡乙素作用下對細(xì)胞進(jìn)行收集，在蛋白提取劑的作用下對蛋白實現(xiàn)有效提取，使用BCA試劑盒對蛋白含量進(jìn)行有效測定。提取蛋白樣品含量40 μg，在SDS-PAGE電泳分離作用下轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上，將蛋白含量為5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h，隨后使比例為1∶1 000的SREBP1c、FASN等一抗在搖床孵育過夜，溫度為4℃。清洗TBST3次，每次清洗時長為10 min，1∶10 000的二抗在室溫條件下孵育1 h，重復(fù)上述清洗操作，當(dāng)ECL顯色后，在G:BOX成像分析系統(tǒng)的作用下獲得條帶，β-actin作為內(nèi)參，在Image J圖像軟件的作用下分析灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1篩選白花前胡乙素給藥濃度 不同濃度白花前胡乙素對卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3增殖均有抑制作用，且隨濃度升高和作用時間延長抑制作用增強(qiáng)，結(jié)合實際篩選結(jié)果，最終選定白花前胡乙素溶液濃度為20、40、60 μmol/L，在卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的毒性濃度作用并不明顯，24 h后可以作為白花前胡乙素的給藥條件。見表2。

表2 不同濃度的白花前胡乙素做用不同時間對SK-OV-3細(xì)胞存活率的影響

2.2白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞遷移的影響 與對照組〔(83.65±4.11)%〕比較，20、40、60 μmol/L白花前胡乙素給藥后，卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的劃痕修復(fù)率〔(41.15±3.05)%、(38.75±2.85)%、(19.68±2.02)%〕均顯著降低(P<0.05)，表明白花前胡乙素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3遷移。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測不同濃度白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中遷移的影響(×400)

2.3白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表達(dá)水平的影響 與對照組比較，20、40、60 μmol/L白花前胡乙素組SK-OV-3細(xì)胞中c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 白花前胡乙素在c-Myc、CyclinD1、SREBP1c、FASN mRNA的表達(dá)水平

2.4白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中SREBP1c/FASN信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 SK-OV-3細(xì)胞在20、40、60 μmol/L白花前胡乙素給藥作用24 h后，與對照組比較，SREBP1c、FASN蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖2、表4。

1～4：對照組、白花前胡乙素20 μmol/L組、白花前胡乙素40 μmol/L組、白花前胡乙60 μmol/L組圖2 白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中SREBP1c/FASN信號通路蛋白表達(dá)的影響

表4 白花前胡乙素對SK-OV-3細(xì)胞中SREBP1c/FASN信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

卵巢癌具有極高的死亡率〔12〕。由于卵巢癌在發(fā)生發(fā)展過程中，其病理類型繁多，發(fā)病前期不易察覺，擴(kuò)散快，缺乏有效的早期篩查及診斷方法，因此卵巢癌作為女性生殖器惡性腫瘤疾病，對廣大女性朋友的生命健康安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。雖然現(xiàn)階段尚不清楚卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，但可以得知其與妊娠、激素、避孕、遺傳及生活飲食習(xí)慣等因素相關(guān)〔13〕。目前臨床上對于卵巢癌治療主要以切除為主，但易復(fù)發(fā)，給患者帶來巨大痛苦，因此探尋有效防治卵巢癌的藥物具有重要意義。研究表明，高脂飲食引發(fā)的能量代謝紊亂是誘導(dǎo)卵巢癌發(fā)生的高危因素〔14〕。腫瘤發(fā)生發(fā)展與惡性轉(zhuǎn)化是一個多因素參與、多階段進(jìn)行的動態(tài)過程。腫瘤細(xì)胞代謝重編程是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，可以使得腫瘤細(xì)胞在不利的生存環(huán)境下保持選擇性的生長優(yōu)勢。腫瘤細(xì)胞代謝重編程涉及糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代謝、脂代謝和核酸代謝等諸多方面。其中，脂代謝在腫瘤細(xì)胞的能量存儲、細(xì)胞增殖及重要信號分子合成等方面起重要作用。脂代謝紊亂是腫瘤的主要特征之一。SREBP1c與FASN在腫瘤細(xì)胞物質(zhì)能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用〔15〕。SREBP1c是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，能夠調(diào)控FASN，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。FASN是乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶，有研究報道，F(xiàn)ASN是一個癌基因，與肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔16〕。研究表明，白花前胡乙素是從中藥植物白花前胡根中提取得到的一種香豆素類化合物，是SREBP1c的選擇性抑制劑。本研究結(jié)果表明，不同濃度的白花前胡乙素對卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3增殖及遷移具有抑制作用，同時白花前胡乙素能夠抑制SREBP1c、FASN的表達(dá)，抑制卵巢癌能量代謝，從而抑制c-Myc、CyclinD1等增殖相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。