張磊 田維毅 王和生 賴陳岑 李妹娟 夏麗 冷傳龍

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550002；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室)

心血管疾病的發(fā)生和死亡呈日益增長的趨勢，作為其重要病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化(AS)的預(yù)防與治療已成為影響人類健康的重點研究對象。AS是脂質(zhì)在動脈血管內(nèi)膜大量積聚使外觀呈現(xiàn)出黃色粥樣硬化斑塊，主要累及大、中動脈。病變過程中兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：脂質(zhì)積聚和炎癥反應(yīng)，循環(huán)往復(fù)，相互影響〔1〕，使脂質(zhì)不斷浸潤，內(nèi)膜損傷加劇，最終纖維帽變薄、斑塊破損、游離，變成血栓，它是基于脂質(zhì)浸潤和損傷反應(yīng)理論基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展的慢性炎癥疾病〔2〕。本實驗希望通過研究制何首烏大黃素通過調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路及其通路相關(guān)因子磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)來明確其防治AS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為中醫(yī)藥防治AS，開發(fā)有效、低毒副作用的抗AS藥物提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗藥物和動物 大黃素購自西安飛達(dá)生物有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；血脂康購自維信生物科技有限公司。6周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠12只，ApoE-/-小鼠72只，體重(20±2)g，均購自貴州醫(yī)科大學(xué)，合格證號編號為SCXK(黔)2012-0001。

1.2試劑 抗mTOR抗體、抗AKT1/AKT2/AKT3抗體、anti-PI3K p85 α抗體、抗mTOR(phospho S2481)抗體均購自美國Abcam公司；RNA純化試劑盒、蛋白Ladder均購自美國Thermo公司；高效RIPA組織細(xì)胞裂解液、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RNAwait、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)膠促凝劑均購自北京索萊寶生物科技有限公司；免染膠試劑盒12%、7.5%，快轉(zhuǎn)液購自美國BIO-RAD公司。

1.3儀器 高速冷凍離心機(jī)購自長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；超低溫冷凍冰箱購自青島海爾特種電器有限公司；全自動酶標(biāo)儀購自上海賽默飛儀器有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀；微電腦PCR儀；化學(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)；蛋白轉(zhuǎn)印槽購自美國BIO-RAD公司；電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4方法

1.4.1造模與給藥 將72只成年雄性ApoE-/-小鼠普食喂養(yǎng)1 w，然后隨機(jī)分成6組：AS模型組、高、中、低劑量組、陽性對照組和大黃素中劑量+雷帕霉素組(聯(lián)合給藥組)，每組12只。正常對照組為成年健康雄性C57BL/6J小鼠12只。采用炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)法合并高脂飼料法進(jìn)行ApoE-/-小鼠AS造模，除正常對照組外，其他6組小鼠用高脂飼料(21%豬油、0.15%膽固醇、78.85%基礎(chǔ)飼料)飼養(yǎng)，并每隔1 d腹部皮下注射脂多糖(LPS)25 μg/只，9 w后，隨機(jī)取一造模小鼠和正常小鼠主動脈，進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察主動脈形態(tài)有AS斑塊的形成證明造模成功后停止LPS給藥；給藥組小鼠基于高脂飲食，高、中、低劑量組小鼠分別按40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌服大黃素，陽性對照組血脂康200 mg/kg灌胃，大黃素中劑量+雷帕霉素組(聯(lián)合給藥組)給予20 mg/kg大黃素及腹部皮下注射雷帕霉素溶液1 mg/kg，所有藥物體積0.5 ml，持續(xù)給藥6 w后取材。

1.4.2生化檢測 采用生化試劑盒，全自動酶標(biāo)儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.4.3組織HE染色 將主動脈血管組織脫水、浸蠟、包埋后切片，按照HE染色試劑盒說明進(jìn)行透明、復(fù)水、染色、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織切片并做圖像采集保存。

1.4.4qRT-PCR檢測mTOR、PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平 提取小鼠心肌組織總RNA50 μl，以RNA為模板，按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，根據(jù)試劑盒說明書，于冰上配制各組反應(yīng)液，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，PI3K：上游引物：5′-GCTCCTGGAAGCCATTGAGAA-3′,下游引物：5′-CGTCGATCATCTCCAAGTCCAC-3′；AKT：上游引物：5′-AGTCCCCACTCAACAACTTCT-3′，下游引物：5′-GAAGGTGCGCTCAATGACTG-3′；mTOR：上游引物：5′-AATACGCCATGAAACACTTCG-3′，下游引物：5′-GGTCTTCCTTGTTTGTGTCCA-3′；β-actin：上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。擴(kuò)增程序：階段1：預(yù)變性，50℃，120 s，循環(huán)1次；95℃，600 s，循環(huán)1次；階段2：熱循環(huán)，95℃，15 s，60℃，60 s，循環(huán)40次；階段3：溶解曲線，65℃，5 s，95℃，5 s，循環(huán)1次。

1.4.5Western印跡檢測心肌組織mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 按BCA試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算心肌蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后置于100℃水浴鍋中孵育5 min，使蛋白質(zhì)變性。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫孵育150 min。TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜完成后孵育對應(yīng)一抗4℃過夜。第2天洗膜3次，再孵育二抗1 h。洗膜3次后顯影，使用ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析相對蛋白表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血脂指標(biāo)水平比較 與模型組比較，給藥各組TC、TG、LDL-C水平均明顯降低(均P<0.05)。除低劑量組外其余給藥組HDL-C水平均明顯高于模型組(均P<0.05)。提示從血脂水平變化上看，制首烏大黃素對脂質(zhì)代謝起一定作用，促進(jìn)血清中HDL-C的合成，加速TC、TG、LDL-C的分解，有降血脂的作用。見表1。

表1 各組血脂指標(biāo)水平及心肌組織mTOR、PI3K、AKT mRNA比較

2.2HE染色觀察小鼠胸主動脈病理改變 模型組內(nèi)膜明顯增厚，可見大的脂質(zhì)核心，斑塊纖維帽變薄并伴有破裂；高劑量組內(nèi)膜稍有增厚；中劑量組內(nèi)膜增厚，稍有破裂，但細(xì)胞排列整體有序；低劑量組內(nèi)膜變薄，有脂質(zhì)堆積，見玻璃樣變形成；陽性對照組內(nèi)膜增厚，斑塊纖維帽較薄；聯(lián)合用藥組內(nèi)膜稍增厚，未見脂質(zhì)。提示高、中劑量組和聯(lián)合用藥組對AS斑塊形成干預(yù)效果好，血管內(nèi)沒有脂質(zhì)堆積，未見斑塊形成，內(nèi)膜未見脂質(zhì)核心，而大黃素低劑量干預(yù)效果不佳。見圖1。

圖1 各組主動脈病理(HE，×400)

2.3各組mTOR、PI3K、AKT mRNA水平比較 與模型組比較，高、中劑量組、陽性對照組和聯(lián)合用藥組mTOR mRNA水平明顯降低(P<0.05)；高、中、低劑量組和聯(lián)合用藥組PI3K mRNA水平明顯降低(P<0.05)。高、中劑量組、聯(lián)合用藥組和陽性對照組AKT mRNA水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。提示制首烏大黃素對mTOR、PI3K、AKT mRNA起抑制影響，但低劑量無明顯作用。

2.4各組心肌組織PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平比較 與模型組比較，高、中劑量組、聯(lián)合用藥組PI3K蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；高、中劑量組AKT蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。高、中、低劑量血、陽性對照組和聯(lián)合用藥組mTOR蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。高、中、低劑量組和聯(lián)合用藥組p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。提示一定劑量的制首烏大黃素對PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)有抑制作用。見表2、圖2。

表2 各組心肌中PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較

1～6：模型組；高劑量組；中劑量組；低劑量組；陽性對照組；聯(lián)合用藥組圖2 各組心肌組織PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平

3 討 論

AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與炎癥、免疫、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝等有關(guān)〔3〕。自噬發(fā)生在真核細(xì)胞內(nèi)，是自身物質(zhì)成分被溶酶體所降解的過程〔4〕。細(xì)胞自噬與脂代謝可以相互影響，細(xì)胞自噬降解脂質(zhì)，還能調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)〔5〕。AS的發(fā)病機(jī)制也與自噬有關(guān)，mTOR是影響巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬的抑制因子，通過抑制其活化可刺激機(jī)體自噬的增加，p-mTOR作為mTOR磷酸化蛋白，是判斷通路活化的判定標(biāo)準(zhǔn)。在AS病理發(fā)展過程中，mTOR信號通路被激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)脂代謝紊亂，調(diào)控細(xì)胞免疫應(yīng)答等〔6〕。有研究表明，在LPS誘導(dǎo)下，mTOR信號通路激活〔7〕。巨噬細(xì)胞通過自噬，調(diào)節(jié)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，拮抗細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮穩(wěn)定AS斑塊的影響〔8〕。mTOR相關(guān)抑制劑是雷帕霉素〔9〕，可抑制平滑肌細(xì)胞增殖。

大黃素是制何首烏游離蒽醌的主要成分，可通過降脂、抗炎等達(dá)到抗AS的作用，且在相互作用中調(diào)節(jié)多條信號通路，如ABCA1、NF-κB、JAK/STAT3等信號通路〔10，11〕。其中，mTOR涉及細(xì)胞炎癥與自噬的調(diào)控中樞，也受到了影響。本研究結(jié)果表明制何首烏大黃素對ApoE-/-小鼠AS模型中的病變有明顯療效，能夠降低血清中TC、TG、LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，起到調(diào)節(jié)血脂及保護(hù)血管的作用，且能夠抑制mTOR信號通路及mTOR信號通路上游PI3K/AKT信號活性，刺激機(jī)體自噬增加，增加糖脂的代謝，從而達(dá)到抗AS的作用，為中藥治療AS提供了新視角。