方慶亮，董昌盛，陳榮，龔卿，陸松，宋仁杰，顧香蓮，王蕾，顧煜愷

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院1.放療科，2.中醫(yī)腫瘤研究所，上海200032）

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增肺癌病死患者180 萬(wàn)例，發(fā)病率、病死率均居惡性腫瘤首位[1]。肺癌的治療效果較差，早期肺癌患者經(jīng)局部治療后5年存活率＜55%[2]。但大部分肺癌患者確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，5年生存率往往＜10%[3]。晚期的局部肺癌患者喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，放療是首選的治療手段之一，而放療抵抗是導(dǎo)致5年生存率偏低的主要原因[4-5]。因此，深入探討影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的因素和機(jī)制，提高放療療效，對(duì)改善肺癌患者5年生存率等預(yù)后指標(biāo)具有重要臨床價(jià)值。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirtuin 3,SIRT3）是重要的線粒體蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等生物學(xué)進(jìn)程，與腫瘤關(guān)系緊密，參與多種癌癥發(fā)生、發(fā)展[6]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box O3,FOXO3）是一類進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等作用[7]。SIRT3/FOXO3 通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8]，但與肺癌放療的關(guān)系尚不明確。本研究將探討SIRT3/FOXO3 通路在肺癌A549細(xì)胞放療抵抗中的作用機(jī)制，以期為提高放療療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

肺癌A549 細(xì)胞系（貨號(hào)：DA-C5831）購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，胎牛血清、蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、SIRT3 抗體、FOXO3抗體、GAPDH 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（ 貨號(hào)：S9030、BC3640、PT0001、K005158P、K001577P、M1000110、SR134）購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司，青霉素、鏈霉素（貨號(hào)：PPSJ-100247、PPSJ-100309）購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基、化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號(hào)：ZY-P0032、ZY-11256）購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司，胰蛋白酶、SIRT3 抑制劑（3-TYP）、CCK-8 試劑、AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：SNM486-HMP、M07155-UKY、QN1293-OIR、WE0325-THR）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（貨號(hào)：CVL-PAB75275、GTX34421）購(gòu)自北京孚博生物科技有限公司，培養(yǎng)箱（型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC）購(gòu)自日本松下公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：ELX800）購(gòu)自BIO-TEK 公司，流式細(xì)胞儀（型號(hào)：BD FACSCanto Ⅱ）購(gòu)自美國(guó)BD 公司，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDocXRS）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將A549 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素、0.1 mg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。

取對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組（A549 細(xì)胞）、放療組（A549 細(xì)胞+X 射線照射）、3-TYP 組（A549 細(xì)胞+50 μmol/L 3-TYP[9]），X 射線+3-TYP 組（A549 細(xì)胞+X 射線照射+50 μmol/L 3-TYP）。

照射方式[10]：室溫條件下采用6 MV X 線照射A549 細(xì)胞，源皮距為100 cm，照射劑量為8 Gy，劑量率為300 cGy/min。

1.3 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖

4組A549細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)：450 nm）檢測(cè)各孔吸光度（optical density,OD）值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡及周期分布

48 h 后收集4 組A549 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，使用400 μl 結(jié)合緩沖液制備細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml 的細(xì)胞懸浮液，加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，避光孵育1 h，使用流式細(xì)胞分析儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

48 h 后收集4 組A549 細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌，用預(yù)冷的70%乙醇固定1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌，用500 μ l RNase/PI 重懸細(xì)胞，避光染色20 min，使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.5 Western blotting 檢測(cè)SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量

48 h 后收集4 組A549 細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。依次進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗（1∶500稀釋的SIRT3抗體、FOXO3抗體、Bcl-2 抗體、Bax 抗體和1∶1 000 稀釋的GAPDH 抗體）4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌，加二抗（1∶1 000 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600 圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，分析SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞增殖情況

各組A549 細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 的OD 值比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的A549 細(xì)胞OD 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=63.098，P=0.000）；②不同組間的A549 細(xì)胞OD 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=82.092，P=0.000）；③各組A549細(xì)胞OD值變化趨勢(shì)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.440，P=0.215）。見圖1和表1。

圖1 各組A549細(xì)胞OD值變化趨勢(shì)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞OD值比較 （n=6，±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞OD值比較 （n=6，±s）

組別對(duì)照組放療組3-TYP組X射線+3-TYP組24 h 0.35±0.07 0.15±0.04 0.47±0.09 0.23±0.06 48 h 0.49±0.10 0.24±0.07 0.64±0.11 0.36±0.09 72 h 0.73±0.13 0.40±0.09 0.94±0.15 0.55±0.11

2.2 各組A549細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組、放療組、3-TYP 組和X 射線+3-TYP組A549 細(xì)胞凋亡率分別為（24.62±7.28）% 、（60.94±13.43）% 、（13.72±5.06）% 和（39.57±11.05）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.326，P=0.000）。放療組、X 射線+3-TYP 組較對(duì)照組升高（P＜0.05），3-TYP 組較對(duì)照組降低（P＜0.05），3-TYP 組、X 射線+3-TYP 組較放療組降低（P＜0.05），X 射線+3-TYP 組較3-TYP 組升高（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 各組A549細(xì)胞凋亡情況

圖3 各組A549細(xì)胞凋亡率比較 （n=6，±s）

2.3 各組A549細(xì)胞周期分布情況

各組A549 細(xì)胞周期分布情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放療組、X射線+3-TYP組G0/G1期A549 細(xì)胞較對(duì)照組增加（P＜0.05），S、G2/M 期A549 細(xì)胞較對(duì)照組減少（P＜0.05）；3-TYP 組G0/G1期A549細(xì)胞較對(duì)照組減少（P＜0.05），S、G2/M 期A549 細(xì)胞較對(duì)照組增加（P＜0.05）；3-TYP 組、X 射線+3-TYP 組G0/G1期A549 細(xì)胞較放療組減少（P＜0.05），S、G2/M 期A549 細(xì)胞較放療組增加（P＜0.05）；X 射線+3-TYP 組G0/G1 期A549 細(xì)胞較3-TYP 組增加（P＜0.05），S、G2/M 期A549 細(xì)胞較3-TYP 組減少（P＜0.05）。見表2 和圖4、5。

表2 各組A549細(xì)胞周期分布比較 （n=6，%，±s）

表2 各組A549細(xì)胞周期分布比較 （n=6，%，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與放療組比較，P ＜0.05；③與3-TYP組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組放療組3-TYP組X射線+3-TYP組F 值P 值S G0/G1 49.16±4.52 68.73±6.57①42.05±4.16①②27.66±4.25 17.51±3.29①33.59±4.48①②G2/M 20.14±3.36 12.03±2.15①24.66±3.55①②58.01±5.36①②③22.25±3.74①②③15.95±2.97①②③18.990 0.001 29.067 0.000 18.336 0.001

圖4 各組A549細(xì)胞周期分布情況

圖5 各組A549細(xì)胞周期分布 （n=6，±s）

2.4 各組A549 細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組A549 細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。放療組、X射線+3-TYP組A549細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P＜0.05）；3-TYP 組A549 細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P＜0.05）；3-TYP 組、X 射線+3-TYP 組A549 細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量較放療組降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較放療組升高（P＜0.05）；X 射線+3-TYP 組A549 細(xì)胞中SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量較3-TYP 組升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較3-TYP 組降低（P＜0.05）。見圖6、7 和表3。

圖6 各組A549細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

圖7 各組A549細(xì)胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表3 各組A549細(xì)胞中SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表3 各組A549細(xì)胞中SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與放療組比較，P ＜0.05；③與3-TYP組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組放療組3-TYP組X射線+3-TYP組F 值P 值Bax/GAPDH 0.28±0.08 0.85±0.16①0.15±0.04①②0.49±0.34①②③15.028 0.000 SIRT3/GAPDH 0.33±0.08 0.86±0.23①0.24±0.05①②0.52±0.12①②③23.714 0.000 FOXO3/GAPDH 0.26±0.07 0.81±0.25①0.17±0.04①②0.48±0.13①②③22.668 0.000 Bcl-2/GAPDH 0.62±0.17 0.23±0.07①0.87±0.21①②0.41±0.12①②③19.768 0.000

3 討論

肺癌局惡性腫瘤死亡率得第1 位，其中85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌。放療是利用大量放射線破壞細(xì)胞DNA，以阻礙細(xì)胞增殖，其在快速生長(zhǎng)分裂的癌細(xì)胞中效果更為顯著，是非小細(xì)胞肺癌的重要治療手段之一[11]。有研究表明，早期無(wú)法手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者放療效率較高，接受放療后的2年、5年局部控制率分別為97.6%和93.0%，3年、5年生存率分別為55.0%和40.0%[12]。但絕大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已處于晚期，臨床治療時(shí)出現(xiàn)放療抵抗，是常見的失敗原因[13]。因此，研究肺癌細(xì)胞放療抵抗的作用機(jī)制，對(duì)增強(qiáng)放療敏感性具有重要意義。

Sirtuin 家族是第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，通過(guò)去乙酰化作用參與氧化途徑，進(jìn)而影響細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程[14]。SIRT3 是Sirtuin 家族成員之一，是線粒體內(nèi)最主要的去乙酰化酶，其缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧增加。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）穩(wěn)定，其靶基因表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[15]。陳祥等[16]研究表明，SIRT3 可能通過(guò)Bax 凋亡信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，放療組A549 細(xì)胞OD 值降低、細(xì)胞凋亡率升高，3-TYP 組A549 細(xì)胞OD 值升高、細(xì)胞凋亡率降低，提示放療可以抑制A549 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制SIRT3 表達(dá)可以促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。

細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程與細(xì)胞周期變化有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，放療組G0/G1 期A549 細(xì)胞增加，S、G2/M 期A549 細(xì)胞減少，3-TYP組G0/G1期A549細(xì)胞減少，S、G2/M 期A549 細(xì)胞增加，提示放療可能促進(jìn)A549 細(xì)胞由S、G2/M 期進(jìn)入G0/G1 期，并將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期，發(fā)揮抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用；抑制SIRT3 表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖，抑制其凋亡；與放療組相比，X 射線+3-TYP 組G0/G1 期A549 細(xì)胞減少，S、G2/M 期A549 細(xì)胞增加，提示抑制SIRT3 表達(dá)可以促使放療后的A549 細(xì)胞脫離G0/G1期，進(jìn)入S 期完成細(xì)胞周期，使A549 細(xì)胞發(fā)生放療抵抗。

FOXO3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、能量代謝等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[8，18]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXO3 能夠在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合其靶基因，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，影響細(xì)胞生物學(xué)特性[19]。FOXO3 是一種抑癌因子，具有磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化等多種化學(xué)修飾作用，其磷酸化產(chǎn)物可抑制其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)轉(zhuǎn)移、降解，從而抑制其抗腫瘤作用[20]。羊麗麗等[21]研究表明，靜息狀態(tài)下FOXO3呈磷酸化水平，受外界刺激后脫磷酸化，誘導(dǎo)Bim等促細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。盧麗琴等[22]研究表明，F(xiàn)OXO3 可被SIRT3 激活發(fā)生去乙?；?，進(jìn)而減少活性氧的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化作用，調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展。Bcl-2、Bax 分別為Bcl-2 家族的抑凋亡成員和促凋亡成員[23]。本研究結(jié)果顯示，放療組A549 細(xì)胞中SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高，Bcl-2 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低，提示放療可通過(guò)上調(diào)Bax 表達(dá)、下調(diào)Bcl-2 表達(dá)從而促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡，且這一過(guò)程伴隨SIRT3、FOXO3 蛋白相對(duì)表達(dá)量變化。進(jìn)一步研究顯示，X 射線+3-TYP 組A549 細(xì)胞中SIRT3、FOXO3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較放療組降低，提示SIRT3受抑制后FOXO3 表達(dá)隨之降低，F(xiàn)OXO3 的表達(dá)可能受SIRT3 調(diào)控，且SIRT3、FOXO3 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低可能與A549 細(xì)胞發(fā)生化療抵抗有關(guān)。推測(cè)激活SIRT3/FOXO3 通路將有助于提高肺癌A549 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，抑制A549 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，為減少放療抵抗提供一個(gè)新的研究思路和治療方法。

綜上所述，SIRT3/FOXO3 通路受抑制后，放療對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用減弱，SIRT3/FOXO3 通路可能與肺癌A549 細(xì)胞放療抵抗有關(guān)，可進(jìn)一步研究SIRT3/FOXO3 通路激活后對(duì)肺癌A549 細(xì)胞放療抵抗的影響，為臨床放療中減少抵抗提供參考。