孫毅，胡耀仁，孫春麗，高國生，丁源華，朱育銀，陳錦春

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）導(dǎo)致的結(jié)核病是全球重要公共衛(wèi)生問題，我國系全球結(jié)核病和耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。近年來非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染呈上升態(tài)勢，其引發(fā)的臨床表現(xiàn)與結(jié)核病十分相似[1]，導(dǎo)致在診療過程中常發(fā)生誤診。因此，在感染早期快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定對于疾病的診斷、治療和控制具有重要意義。基因芯片技術(shù)作為新興的分子生物學(xué)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)分枝桿菌基因突變位點(diǎn)的檢測，區(qū)別MTB和NTM，并快速鑒定NTM種群。本文回顧性分析中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院過去4年間應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測痰液標(biāo)本的情況，揭示MTB的耐藥狀況和NTM菌種分布情況，以期為結(jié)核及相關(guān)疾病的個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供指導(dǎo)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2016年2月至2020年9月對1 654例患者進(jìn)行了痰液基因芯片檢測，排除陰性（821例）、無法判讀者（14例）及結(jié)果不全者（127例）者，最終納入患者692例。

1.2 主要試劑與儀器 ABI StepOnePlus基因擴(kuò)增儀、LuxScanTM 10K/B微陣列芯片掃描儀、BioMixerTM II芯片雜交儀、SlideWasherTM芯片洗干儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒及盒蓋若干套、晶芯MTB耐藥基因檢測試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定診斷試劑盒均由北京博奧生物集團(tuán)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因芯片檢測

1.3.1.1 痰標(biāo)本處理及DNA提取 取1 ml痰標(biāo)本加入等量的液化液，對痰標(biāo)本進(jìn)行前處理。以13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml洗液于沉淀中，混勻后繼續(xù)以10 000 r/min離心2 min，棄去上清液。向剩余沉淀中加入50 l裂解液，混勻后置于沸水10 min，以10 000 r/min離心2 min，取上清液待用。

1.3.1.2 PCR擴(kuò)增 按照加樣順序準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管，并在管蓋和管身做好相應(yīng)標(biāo)記；根據(jù)樣本數(shù)量分裝PCR擴(kuò)增試劑1/2/3，每份樣本3個(gè)體系，分別分裝18 l；將模板DNA即上清液及對照品以2.0 l/管，加入到對應(yīng)的3個(gè)反應(yīng)體系的PCR管中，體系共計(jì)20 l，混勻后瞬時(shí)離心。將PCR擴(kuò)增管置于PCR擴(kuò)增儀中，按37℃600 s，94℃600 s；94℃30 s，60℃30 s，72℃40，熱循環(huán)35次；94℃30 s，72℃60 s，熱循環(huán)10次；72℃420 s進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3.1.3 芯片雜交 從試劑盒B中取出雜交緩沖液，50℃溫浴使其完全融化；將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中95℃變性5 min，隨后立即置于冰水混合物中至少3 min；按照9 l雜交緩沖液，3 l+3 l PCR產(chǎn)物的比例配制雜交混合物。按照雜交盒（在雜交盒溝槽中加入200 l純化水），托架，芯片，蓋片的順序裝配好雜交反應(yīng)盒；吸取13.5 l雜交混合物經(jīng)加樣孔加入芯片點(diǎn)陣中，注意不要將氣泡加入反應(yīng)池中，蓋好盒蓋并用金屬條密封雜交盒；50℃預(yù)熱BioMixerTMII芯片雜交儀20 min以上，完成后將雜交盒平穩(wěn)放入雜交儀托盤，并注意將3只或6只雜交盒全部放入，以使托盤平衡；運(yùn)行結(jié)核耐藥基因檢測芯片雜交程序，雜交條件為50℃雜交2 h，轉(zhuǎn)速為5 r/mim。

1.3.1.4 洗滌干燥 使用20×SSC，10%SDS，根據(jù)需要及實(shí)際情況，按如下比例配制洗滌液Ⅰ和Ⅱ。洗滌液I：依次將純化水，20×SSC，10%SDS按照88∶10∶2的比例配置；洗滌液II：依次將純化水，20×SSC按照99∶1的比例配置；預(yù)熱SlideWasherTM芯片洗干儀，待儀器屏幕顯示“請放入芯片進(jìn)行洗滌”時(shí)即可放入完成雜交的芯片，運(yùn)行MTB耐藥基因檢測芯片洗滌程序進(jìn)行洗滌，儀器屏幕顯示“請將芯片放入甩干倉”時(shí)，表示洗滌已經(jīng)完成，即可將芯片對稱的放入甩干倉，點(diǎn)擊確定開始甩干。

1.3.1.5 掃描判讀 使用晶芯Lux-ScanTM 10 K/B微陣列芯片掃描儀和晶芯MTB耐藥檢測芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行信號讀取及結(jié)果判斷。

1.3.2 分枝桿菌菌種鑒定 嚴(yán)格按照分枝桿菌菌種鑒定診斷試劑盒說明書對菌種進(jìn)行鑒定，包括MTB復(fù)合群與NTM的17個(gè)種或群（胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌等）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片檢測結(jié)果 MTB 514例（74.17%），NTM 178例（25.69%）（其中97例進(jìn)行了種群分析）。

2.2 MTB的耐藥情況 514例MTB中，兩藥均敏感占80.35%，單耐利福平、單耐異煙肼、耐多藥（利福平和異煙肼）分別占4.47%、4.86%、10.31%。初治組兩藥均敏感的比例高于復(fù)治組（P＜0.05），而復(fù)治組單耐利福平和耐多藥比例高于初治組（均P＜0.05）。見表1。

表1 MTB的耐藥情況 例（%）

2.3 不同性別、年齡MTB患者的耐藥情況 MTB患者以男性和40歲以上人群為主，分別占比72.96%、68.29%。不同性別和年齡組患者的耐藥率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同性別、年齡MTB患者的耐藥情況 例（%）

2.4 MTB對利福平和異煙肼相關(guān)耐藥基因突變位點(diǎn)分布 單耐利福平ropB突變位點(diǎn)以531（C→T）和526（A→G）為主，均為單一位點(diǎn)突變；單耐異煙肼突變位點(diǎn)以KatG基因315（G→C）為主，均為單一位點(diǎn)突變。耐多藥中雙位點(diǎn)突變46例（86.79%），3位點(diǎn)突變6例（11.32%），5位點(diǎn)突變1例（1.89%）。突變頻率最高的是531（C→T）/315（G→C），見表3～4。

表3 單耐利福平和異煙肼相關(guān)耐藥基因突變位點(diǎn)分布

2.5 NTM菌種分布情況 97例NTM中種群達(dá)7種，以胞內(nèi)分枝桿菌（38.14%）、鳥分枝桿菌（31.96%）和龜/膿腫分枝桿菌（16.49%）為主，見封三彩圖1。

圖1 NTM菌種分布情況

3 討論

基因芯片是通過微陣列技術(shù)將大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，檢測利福平rpoB、異煙肼katG和inhA等多個(gè)突變位點(diǎn)，以便快速檢測兩種一線藥物的耐藥性。此外，該法還可以快速檢測多種臨床常見NTM。

本研究結(jié)果顯示，MTB患者利福平/異煙肼的耐藥率為19.65%，與陜西省西安市報(bào)道的19.52%結(jié)果較為一致[2]，但低于新疆阿克蘇地區(qū)報(bào)道的34.9%[3]。這說明地域差異可能是肺結(jié)核患者利福平/異煙肼耐藥率不同的影響因素之一。復(fù)治組耐利福平和異煙肼兩藥的比例（28.23%）高于初治組（4.62%），均略高于2014年WHO結(jié)核病的報(bào)告結(jié)果（初治病例占3.3%，復(fù)治病例占20.0%）[4]；同時(shí)耐兩藥率高于浙江省水平（3.46%）[5]。這說明本地區(qū)MTB耐藥情況較為嚴(yán)重。復(fù)治患者耐多藥率較高的原因：（1）由于病情遷延不愈導(dǎo)致機(jī)體抵抗力較差；（2）長期治療，醫(yī)囑依從性下降；（3）復(fù)治患者可能存在濫用藥物、不規(guī)范治療。

表4 耐多藥（利福平和異煙肼）的基因突變位點(diǎn)分布

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者中男性占比高于女性患者，＜20歲的患者比例最低，而≥60歲的占比最高，且患者比例隨著年齡升高而增加，但不同性別和年齡組的肺結(jié)核患者耐藥率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。這說明老年男性是MTB感染的主要人群，與安徽省阜陽地區(qū)的結(jié)論一致[6]。這可能與老年人群抵抗力差、合并糖尿病和高血壓等并發(fā)癥有關(guān)。需要指出的是，本地區(qū)＜20歲組人群的耐藥率最高（33.33%），與既往文獻(xiàn)報(bào)道不同[7]，這可能與樣本量較小導(dǎo)致的分析偏倚有關(guān)，確切結(jié)論需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入的探討。

MTB對利福平和異煙肼相關(guān)耐藥基因突變位點(diǎn)分布結(jié)果顯示，單耐利福平ropB突變位點(diǎn)以531（C→T）為主，單耐異煙肼突變位點(diǎn)以KatG基因315（G→C）為主，耐多藥突變頻率最高的是531（C→T）/315（G→C），這與既往結(jié)果基本一致[7-8]，而其他突變位點(diǎn)分布略有不同，考慮系區(qū)域差異及標(biāo)本量不同所致。

近年來NTM感染的發(fā)病率和患病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。由于NTM的臨床表現(xiàn)與結(jié)核相似，使得臨床上常常發(fā)生誤診。鑒于兩者的治療方案差異較大，因此對分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定至關(guān)重要。本研究NTM感染率占25.69%，高于徐州地區(qū)[9]。NTM種群以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌為主，與龍巖市一致[10]，而與長沙市略有不同[11]。

綜上所述，基因芯片技術(shù)可作為臨床分枝桿菌感染診斷的重要檢測手段，目前本地區(qū)MTB耐藥和NTM感染形勢較嚴(yán)峻，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測和防控工作。