徐倩，付瑞燕

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036)

大量研究表明，能夠作為人類胃腸道中益生菌的乳酸桿菌具有抗氧化、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等重要生物學(xué)功能，其廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)[1-3]。但是在工業(yè)應(yīng)用中，乳酸桿菌會(huì)面臨多種物理或化學(xué)脅迫作用，如膽鹽脅迫、酸脅迫、氧脅迫、冷凍脅迫等，進(jìn)而影響細(xì)胞的許多重要生理功能，降低細(xì)胞的活力，制約著相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)[4-5]。在環(huán)境脅迫中，乳酸桿菌的細(xì)胞活力受到損傷，受損傷程度與其自身抗性大小密切相關(guān)，抗性越強(qiáng)的細(xì)胞越能耐受工業(yè)生產(chǎn)過程，維持細(xì)胞活力，從而在最終產(chǎn)品中表現(xiàn)出其相應(yīng)的作用。因而，改善乳酸桿菌的環(huán)境脅迫抗性具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，近年來選育具有多種脅迫抗性乳酸桿菌菌株的研究受到廣泛關(guān)注[6-8]。脅迫抗性一般是基于對(duì)細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別來進(jìn)行表征的。目前，國內(nèi)外主要采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)量(CFU)從而計(jì)算脅迫抗性[9]，該法主要是通過梯度稀釋使菌懸液中的細(xì)胞充分分散后，接種平板培養(yǎng)，形成肉眼可見的菌落，假定每個(gè)菌落是1個(gè)活細(xì)胞形成的，計(jì)算得到活菌數(shù)量。此方法操作要求較高，如在稀釋時(shí)需要充分混勻菌液，否則人為造成的誤差較大[10]。近年報(bào)道的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)可區(qū)分未受損、受損和受脅迫細(xì)胞[11]，但是對(duì)受損和受脅迫細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定并不能完全表征出細(xì)胞經(jīng)脅迫后繁殖力損傷的多少，而經(jīng)脅迫后細(xì)胞具有多少殘存繁殖力對(duì)于工業(yè)應(yīng)用是非常必要的，如經(jīng)胃酸脅迫后細(xì)胞如能快速恢復(fù)繁殖力，則有助于其在體內(nèi)定殖，因而需要對(duì)有生長能力的乳酸桿菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。比濁法通過培養(yǎng)液的吸光度(濁度)來間接表示細(xì)胞生長情況，是國內(nèi)外通用的方法。本研究擬采用比濁法測(cè)定2種供試的乳酸桿菌菌株(發(fā)酵乳桿菌415和植物乳桿菌LGD)經(jīng)脅迫后再培養(yǎng)的生長特性，并研究該法與稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，來探究用比濁法測(cè)定乳酸桿菌脅迫存活率的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基

發(fā)酵乳桿菌415和植物乳桿菌LGD由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。所用培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁；752紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HYQ—3110漩渦混合器，上海珂淮儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳桿菌415酸脅迫生物量比曲線的測(cè)定

將活化后的對(duì)數(shù)期發(fā)酵乳桿菌415用生理鹽水將濁度(OD600)調(diào)整至4.0，以5%的接種量轉(zhuǎn)接至MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取5 mL發(fā)酵液離心(8 944×g, 5 min)去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于pH 2.3的鹽酸溶液中，37 ℃下水浴30 min后，離心(8 944×g, 5 min)去上清液，用生理鹽水洗滌菌體1次，重懸于等量的生理鹽水中，以5%的接種量接種至20 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)，每隔1 h取樣測(cè)定生物量(OD600)，得到OD脅，對(duì)照組用生理鹽水代替鹽酸溶液，其余處理與實(shí)驗(yàn)組一致，得到OD對(duì)。每組設(shè)3個(gè)平行樣。生物量比=OD脅/OD對(duì)。

1.2.2 不同酸脅迫時(shí)間下比濁法測(cè)定生物量比曲線和稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定存活率

用1.2.1同樣的方法將發(fā)酵乳桿菌415在pH 2.3的鹽酸溶液中、37 ℃下分別水浴15、50、100、150、180 min 后，取5 mL發(fā)酵液離心(8 944×g, 5 min)去上清液，生理鹽水洗滌后重懸于等量的生理鹽水中，用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌懸液存活率，并以5%的接種量將菌懸液接種至20 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)，根據(jù)脅迫程度在合適的時(shí)間取樣測(cè)定生物量(OD600)，對(duì)照組用生理鹽水代替鹽酸溶液，其余處理與1.2.1的一致，得到不同酸脅迫條件下生物量比曲線。

酸脅迫存活率的測(cè)定：取經(jīng)酸脅迫且重懸于生理鹽水的菌懸液，用混勻器充分混勻，進(jìn)行梯度稀釋，吸取10 μL 稀釋菌液在MRS固體培養(yǎng)基上點(diǎn)樣，每個(gè)稀釋度點(diǎn)5個(gè)平行，待表層菌液被吸收后，放入37 ℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)至菌落長出，對(duì)每個(gè)稀釋度平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)以重懸于生理鹽水條件下的菌懸液作為對(duì)照，計(jì)算存活率。存活率=脅迫后的菌落數(shù)/對(duì)照菌落數(shù)。計(jì)算存活率時(shí)，考慮了誤差的傳遞。誤差傳遞公式為：

(1)

式中：A，脅迫后的菌落數(shù)；ΔA，脅迫后的誤差；B，對(duì)照的菌落數(shù)；ΔB，對(duì)照的誤差；C，存活率；ΔC，存活率誤差。

1.2.3 酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程對(duì)于發(fā)酵乳桿菌415其他類型脅迫存活率測(cè)定的適用性

膽鹽脅迫：將經(jīng)生理鹽水洗滌的發(fā)酵乳桿菌415重懸于0.001%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽鹽溶液中37 ℃下水浴45、90 min，其他操作方法與酸脅迫一致。

H2O2和NaCl脅迫：分別將經(jīng)生理鹽水洗滌的發(fā)酵乳桿菌415在室溫下重懸于500 mmol/L H2O2溶液中45、60、90 min以及400 mmol/L NaCl溶液中60、80 min，其他操作方法與酸脅迫一致。

冷凍脅迫：將經(jīng)生理鹽水洗滌的發(fā)酵乳桿菌415重懸于等量滅菌生理鹽水中，分裝于無菌離心管中，取出適量菌懸液作為對(duì)照組，其余的置于-20 ℃下，分別于第0.5、2天取出在室溫解凍作為脅迫組，其他操作方法與酸脅迫一致。

以上脅迫實(shí)驗(yàn)均用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定存活率，計(jì)為存活率真值，用分光光度計(jì)比濁法測(cè)定生物量比，獲得存活率擬合值。

1.2.4 比濁法測(cè)定植物乳桿菌LGD脅迫存活率

將活化后的對(duì)數(shù)期植物乳桿菌LGD用生理鹽水將濁度(OD600)調(diào)整至4.5，在pH 2.5鹽酸溶液中分別脅迫0.5、1、2.5、3、4 h后，用1.2.2中的方法測(cè)定取樣時(shí)間點(diǎn)的生物量比和存活率之間的線性相關(guān)，獲得酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程的適用性，酸脅迫條件是37 ℃，pH 2.5的鹽酸溶液中水浴3.5 h以及pH 2.7的鹽酸溶液中水浴1 h；膽鹽脅迫的條件是37 ℃下0.001%膽鹽溶液中水浴40、100 min；H2O2脅迫條件是室溫下在200 mmol/L H2O2溶液中水浴30、90 min。以上脅迫實(shí)驗(yàn)均用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定存活率，計(jì)為存活率真值，用分光光度計(jì)比濁法測(cè)定生物量比，獲得存活率擬合值。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)酸脅迫的發(fā)酵乳桿菌415的生長性能

在各種環(huán)境脅迫中，乳酸桿菌經(jīng)常面臨的脅迫是酸脅迫，其在發(fā)酵生產(chǎn)以及在人體胃液中都會(huì)遭遇酸脅迫的影響。乳酸桿菌屬于嗜中性微生物，當(dāng)處于較低pH值的環(huán)境條件下時(shí)，高濃度的H+會(huì)損傷細(xì)胞膜上的蛋白，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；環(huán)境pH過低也會(huì)使細(xì)胞內(nèi)pH值隨之降低，影響細(xì)胞中多種對(duì)酸敏感的酶活性，細(xì)胞糖降解速率降低，影響細(xì)胞能量的產(chǎn)生，從而限制菌體本身的生長和代謝。如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵乳桿菌415在pH 2.3條件下脅迫30 min后重新接種新鮮MRS培養(yǎng)基，與對(duì)照組(未脅迫)相比，其生長曲線延滯期明顯延長。微生物延滯期的長短與許多因素有關(guān)，在菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相同條件下，延滯期的長短主要與接種量密切相關(guān)。因此，經(jīng)過酸脅迫后，部分發(fā)酵乳桿菌415細(xì)胞活性受到嚴(yán)重?fù)p傷，失去繁殖的能力，活細(xì)胞數(shù)減少，將脅迫后的菌液接種新鮮培養(yǎng)基后，其生長曲線會(huì)有相應(yīng)的響應(yīng)。由脅迫組和對(duì)照組的生物量比值繪制得到的生物量比曲線呈現(xiàn)出先下降后上升的特點(diǎn)，在4 h時(shí)生物量比最低，可能的原因是對(duì)照組在4 h 時(shí)已進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而脅迫組在4 h時(shí)還處于延滯后期，導(dǎo)致此時(shí)脅迫組與對(duì)照組生物量比值最低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，脅迫組開始快速生長，導(dǎo)致脅迫組與對(duì)照組生物量的比值開始增加。

圖1 發(fā)酵乳桿菌415經(jīng)pH 2.3鹽酸溶液脅迫30 min的 生物量曲線和生物量比曲線Fig.1 Biomass curve and biomass ratio curve of Lactobacillus fermentum 415 under 30 min acidic stress in pH 2.3 HCl solution

從圖1可以看出，生物量比曲線谷底后1 h(即第5 h)的生物量比值與培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)量可能成正相關(guān)，即此時(shí)培養(yǎng)體系中活細(xì)胞數(shù)越多，在5 h時(shí)脅迫組的生物量越高，那么生物量比值就會(huì)越高，該點(diǎn)定為取樣時(shí)間點(diǎn)。為驗(yàn)證這一推測(cè)，分別測(cè)定了發(fā)酵乳桿菌415經(jīng)pH 2.3鹽酸溶液脅迫15、50、100、150、180 min的生物量比曲線和細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖2)，當(dāng)脅迫程度較高時(shí)(即酸脅迫時(shí)間較長)，生物量比曲線上谷底出現(xiàn)的時(shí)間會(huì)比脅迫程度較低的延遲，谷底也沒有那么明顯，即出現(xiàn)1個(gè)低谷期而不是1個(gè)低谷值。結(jié)合生物量曲線，表明脅迫時(shí)間越長，菌懸液中活細(xì)胞數(shù)越少，因而在再培養(yǎng)過程中延滯期延長，取樣時(shí)間點(diǎn)因此往后延遲，脅迫組的生長速率因此減慢，在取樣時(shí)間點(diǎn)后的生物量比值增幅也因此減小，從而形成低谷期。

a-脅迫15 min;b-脅迫50 min;c-脅迫100 min;d-脅迫150 min;e-脅迫180 min圖2 發(fā)酵乳桿菌415經(jīng)pH 2.3鹽酸溶液脅迫不同時(shí)間的生物量曲線和生物量比曲線Fig.2 Biomass curves and biomass ratio curves of L.fermentum 415 under different duration of acidic stress in pH 2.3 HCl solution

以存活率為橫坐標(biāo)，不同脅迫條件下生物量比曲線谷底后1 h(取樣時(shí)間點(diǎn))的生物量比值作為縱坐標(biāo)，即經(jīng)pH 2.3鹽酸溶液脅迫15、50、100、150、180 min再接種培養(yǎng)的第4、6、6、6、8 h的生物量比值，繪制存活率與生物量比之間的關(guān)系曲線，對(duì)其進(jìn)行回歸分析(圖3)，結(jié)果顯示，在存活率為0.06～0.85時(shí)，兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997 1，而其他時(shí)刻生物量比與存活率之間線性相關(guān)不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。因而此方程可作為標(biāo)準(zhǔn)方程，即發(fā)酵乳桿菌415經(jīng)酸脅迫后用比濁法得到的生物量比代入此方程，即可得到存活率值。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，在兩次酸脅迫實(shí)驗(yàn)中，酸脅迫后存活率分別為0.156±0.054和0.347±0.067的菌懸液取樣時(shí)間點(diǎn)的生物量比值分別為0.199±0.006和0.363±0.011，代入此方程后，計(jì)算所得的擬合存活率分別為0.161和0.322，存活率真值與擬合值之間的誤差率為-3.54%和7.09%，均小于10%，表明比濁法測(cè)定酸脅迫存活率具有良好的可靠性。

圖3 發(fā)酵乳桿菌415取樣時(shí)間點(diǎn)的生物量比 和存活率之間的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.fermentum 415 under acidic stress at sampling point

2.2 比濁法酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)定不同脅迫類型存活率的適用性

乳酸桿菌會(huì)面臨各種不同類型的脅迫[12-13]，并且脅迫損傷機(jī)理差異較大，例如膽鹽會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，降低胞內(nèi)pH[14]；冷凍脅迫會(huì)使某些蛋白質(zhì)折疊速率減緩或低效，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性等，從而劇烈干擾細(xì)胞的正常代謝[15]。為評(píng)價(jià)前述得到的比濁法酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程是否可以用于測(cè)定其他類型脅迫存活率，將發(fā)酵乳桿菌415分別經(jīng)H2O2脅迫、膽鹽脅迫、冷凍脅迫和NaCl脅迫，測(cè)定生物量比和存活率，將取樣時(shí)間點(diǎn)的生物量比值代入酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程求得擬合存活率，將擬合存活率與真值結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示，兩者之間的誤差率均小于10%，表明比濁法測(cè)定不同脅迫類型存活率具有良好的可靠性。可見，該標(biāo)準(zhǔn)方程不是只能用于酸脅迫，而是基于待測(cè)菌液中存活的細(xì)胞數(shù)，不論這些殘存的活細(xì)胞是經(jīng)過怎樣的脅迫(物理的或化學(xué)的)，只要是存活的，可能就適用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方程。

表1 分光光度計(jì)比濁法酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)定發(fā)酵乳桿菌 415不同類型脅迫下存活率的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)Table 1 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.fermentum 415 under different type of stress

2.3 比濁法測(cè)定植物乳桿菌LGD脅迫存活率

為驗(yàn)證比濁法是否可以應(yīng)用于測(cè)定其他乳酸桿菌脅迫存活率，下面以植物乳桿菌LGD為研究對(duì)象，建立其酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程，結(jié)果如圖4所示，將植物乳桿菌LGD經(jīng)pH 2.5脅迫不同時(shí)間，存活率為0.098～0.803，比濁法測(cè)定結(jié)果與稀釋平板法之間線性關(guān)系良好，R2=0.998 7。相比發(fā)酵乳桿菌415，其存活率線性范圍較窄，可能是因?yàn)橹参锶闂U菌的對(duì)數(shù)期(7 h)比發(fā)酵乳桿菌(9 h)的短，因而當(dāng)脅迫程度較大時(shí)，脅迫組延滯期剛結(jié)束，對(duì)照組已進(jìn)入穩(wěn)定期，這樣對(duì)照組生物量會(huì)包含部分死細(xì)胞，就會(huì)偏離生物量比與存活率之間的線性相關(guān)。用酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程，結(jié)果如表2所示，存活率真值與擬合值之間的誤差率均小于10%，表明比濁法可以用來準(zhǔn)確測(cè)定植物乳桿菌LGD酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫存活率。

圖4 經(jīng)酸脅迫的植物乳桿菌LGD取樣時(shí)間點(diǎn)的 生物量比和存活率之間的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.plantarum LGD under acidic stress at sampling point

表2 分光光度計(jì)比濁法酸脅迫標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)定植物 乳桿菌LGD不同類型脅迫下存活率的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)Table 2 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.plantarum LGD under different type of stress

3 討論與結(jié)論

比濁法常用于抗生素的抑菌性能研究，但報(bào)道大多以優(yōu)化指示菌初始濃度、培養(yǎng)時(shí)間等因素，使抗菌物質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)與濁度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，從而確定比濁法測(cè)定抑菌活性的方法[16]。而本課題組前期已建立的分光光度計(jì)比濁法測(cè)定細(xì)菌素乳酸鏈球菌素、類細(xì)菌素NFL和抗生素硫酸慶大霉素這3種抗菌物質(zhì)效價(jià)[17]，是找到了抗菌劑效價(jià)線性定量測(cè)定的關(guān)鍵因子，即取樣時(shí)間點(diǎn)，從而使抑菌率與抗菌物質(zhì)濃度之間直接建立線性關(guān)系。與本文所報(bào)道的方法不同，其取樣時(shí)間點(diǎn)是以抑菌率最高時(shí)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為取樣時(shí)間點(diǎn)。

FERRANDO等[5]研究了NaCl濃度對(duì)于植物乳桿菌生長性能的影響，在20 h的培養(yǎng)期內(nèi)每隔30 min 取樣1次，測(cè)定濁度OD570，計(jì)算出最大比生長速率(μmax)，從而可以得到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間在存活率上的差異。該法需要多次取樣，工作量較大，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法與稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法之間相關(guān)聯(lián)，因而無法與他人的研究結(jié)果相比較。對(duì)于需要測(cè)定一個(gè)乳酸桿菌菌株多種脅迫抗性的研究而言，本文所建立的分光光度計(jì)比濁法測(cè)定脅迫存活率是一個(gè)有效的方法，只需測(cè)定該菌株一種脅迫的比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程并驗(yàn)證其他類型脅迫的適用性后，就可以通過測(cè)定生長曲線來獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線存活率范圍內(nèi)不同脅迫程度下的存活率值。這不僅可以減少由于稀釋操作不可避免帶來的較大誤差，還可以減少檢測(cè)時(shí)間。以植物乳桿菌LGD為例，比濁法測(cè)定樣品存活率所需時(shí)間最多為7 h，與稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法需要48 h相比，檢測(cè)所用時(shí)間明顯縮短，具有一定的優(yōu)勢(shì)，從而有利于實(shí)現(xiàn)乳酸桿菌脅迫抗性的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。