華彥濤，劉波，趙炫，尹凱丹，馬楠楠,2，袁利鵬*

1(廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州,510665)2(廣東萬聯(lián)生物科技有限公司，廣東 廣州,510663)

2, 4-二氯苯氧乙酸是高效、內(nèi)吸、具高度選擇性的除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑，被廣泛用于禾科類作用的除草劑、生長調(diào)節(jié)劑和水果保鮮劑[1]。近期浙江、江蘇等地監(jiān)管部門在水果、豆芽中仍檢測出超標(biāo)的2,4-二氯苯氧乙酸。相關(guān)毒理實(shí)驗(yàn)研究表明，2,4-二氯苯氧乙酸作為作物的除草劑和蔬果保鮮劑，其過高的殘留會對人的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成影響，具有潛在致癌性和致突變性[2-3]。在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥殘留最大限量》中規(guī)定谷物、蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸的最高殘留限量分別為2.0、0.5、1.0 mg/kg。

目前，國內(nèi)對苯氧乙酸類激素的檢測方法主要有氣相色譜法[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)[8-11]、分子印跡傳感器法[12]、拉曼光譜檢測法[13]和免疫檢測法[14-16]。色譜類儀器檢測方法準(zhǔn)確率高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，同時也存在設(shè)備昂貴、需專業(yè)人員、前處理要求高等不足。傳感器和拉曼光譜分析方法多停留在研究層次，實(shí)際應(yīng)用率偏低。而基于抗原抗體特異性識別為基礎(chǔ)的免疫快速篩選方法，已經(jīng)成為食品安全檢測方法的主流檢測方法[17-20]，與儀器方法互補(bǔ)使用。微孔側(cè)流免疫層析法(microwell lateral flow immunochromatography, mwLFIA)是一種類似于膠體金層析卡，但又存在差別的檢測方法[21]。其主要原理是：將待測物與標(biāo)記免疫金抗體在微孔中充分結(jié)合，通過層析作用，固相載體的包被抗原會捕獲金標(biāo)抗體而聚集顯色，待測物越多，結(jié)合的抗體約多，固相載體上的包被抗原結(jié)合的少，顯色不明顯，表明陽性，反之則為陰性。微孔的使用，使得金標(biāo)抗體與樣品在微孔中首先接觸，充分反應(yīng)，有效地解決了傳統(tǒng)的膠體金中抗原抗體反應(yīng)不充分或競爭力弱而帶來的假陰性和靈敏度偏低的問題。目前微孔測流免疫層析法已經(jīng)用于食品中抗生素類藥物、他達(dá)那非類藥物殘留的檢測[21-22]，但檢測苯氧乙酸類激素的mwLFIA還未見報(bào)道。

本研究利用采用活潑酯法制備了人工抗原，通過動物免疫獲得了針對2,4-二氯苯氧乙酸的特異性抗體。通過試驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了靈敏度好，前處理簡單，檢測時間較短的mwLFIA，該方法能夠用于水果、蔬菜和谷物類苯氧乙酸類激素殘留的檢測，為農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，上海阿拉丁試劑有限公司；牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)、OVA和羊抗鼠IgG 抗體，美國Sigma 公司；硝酸纖維素膜，美國Ahlstrom 公司；吸水紙H-8和底板J-B6，基因有限公司；金標(biāo)復(fù)溶液、緩沖液，廣州萬聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑，廣州化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3010紫外可見分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司；HGS 510劃膜噴金機(jī)和HGS 201切條機(jī)，杭州峰航科技有限公司；膠體金免疫層析讀數(shù)儀，南京微測生物科技有限公司；LC-15C液相色譜儀，島津(上海)商貿(mào)有限公司；5417R高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；氮吹儀，康寧科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗體制備

采用活潑酯法將2,4-二氯苯氧乙酸與載體蛋白BSA 偶聯(lián)作為免疫原，載體蛋白OVA偶聯(lián)得到包被原(圖1)，采用紫外掃描法進(jìn)行鑒定，-20 ℃凍存。將鑒定成功的免疫原，免疫雌性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過辛酸硫酸銨沉淀法純化抗體，并于-20 ℃凍存。

圖1 免疫原與包被原的制備Fig.1 Preparation of immunogen and coating antigen

1.3.2 制備納米金

（二）病理變化 剖檢見腹腔有少量黃色或淡紅色腹水，漿膜表面有出血斑點(diǎn)。剖檢變化主要發(fā)生在肝臟，肝臟色黃腫大，質(zhì)脆，嚴(yán)重的有灰黃色壞死灶，小葉中心出血和間質(zhì)明顯增生，質(zhì)地變硬，膽囊萎縮，膽汁少而濃。大腿前和肩下區(qū)的皮下肌肉內(nèi)發(fā)生出血，其他部位也常見肌肉出血，胃底彌漫性出血，有的出現(xiàn)潰瘍，腸道有出血性炎癥，胃腸道中有血凝塊，腎臟腫脹，蒼白或淡黃色，全身淋巴結(jié)腫脹，充血。脾臟通常無變化 ，心外膜和心內(nèi)膜有明顯出血，脂肪黃染，有時結(jié)腸漿膜呈膠樣浸潤，通過對臨床癥狀和剖檢病理變化的分析，初步懷疑是霉玉米引起的黃曲霉素中毒。再做實(shí)驗(yàn)室診斷。

采用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取99 mL蒸餾水置于500 mL燒瓶中，加入1 mL 1%的氯金酸溶液，加熱至沸騰并持續(xù)1 min后，迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，觀察溶液顏色，當(dāng)溶液變?yōu)榧t色并逐步穩(wěn)定后，再繼續(xù)加熱3 min后冷卻、備用。制備好的膠體金紫外掃描鑒定，確定最大吸收峰波長，觀察吸收峰的峰形和峰寬。

1.3.3 納米金抗體標(biāo)記條件優(yōu)化

納米金與抗體結(jié)合是基于靜電吸附作用，這種吸附穩(wěn)定性與標(biāo)記溶液pH密切相關(guān)。若納米金溶液的pH不合適，反應(yīng)后的金溶液不穩(wěn)定易聚集沉淀，只有在合適pH，標(biāo)記抗體效率最高，結(jié)合物較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)利用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)納米金溶液的pH 值分別為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，各加入適量抗體進(jìn)行振蕩10 min標(biāo)記，再加入20 μL 10% BSA溶液振蕩15 min封閉，10 000 r/ min 離心15 min后棄上清液，加入等體積復(fù)溶液，裸眼觀察復(fù)溶情況，測定各復(fù)溶液在525 nm 處的吸光值，將易復(fù)溶、吸光值最高的復(fù)溶液的pH 值作為最佳標(biāo)記pH 值。

1.3.4 標(biāo)記抗體濃度優(yōu)化

在標(biāo)記過程中，抗體用量少，則難以復(fù)溶，如果用量過多，會造成資源浪費(fèi)。在已確定pH 值的納米金溶液中加入適量抗體(1.0 mg/mL)，終質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，振蕩孵育10 min 后，加入 10% BSA溶液 封閉10 min，離心后棄上清液，觀察復(fù)溶情況和525 nm 吸光值，選擇維持納米金溶液為紅色的最低抗體濃度為最佳抗體標(biāo)記濃度。

1.3.5 金標(biāo)抗體用量和包被原濃度的優(yōu)化

標(biāo)記抗體與包被原濃度的平衡對方法的建立至關(guān)重要。若金標(biāo)抗體的含量過多，會導(dǎo)致假陰性，反之會造成假陽，都會降低方法的靈敏度。因此本研究通過棋盤法找出兩者之間最優(yōu)組合。分別將包被抗原稀釋1、2、3、4倍，金標(biāo)抗體稀釋2、3、4、5倍，同時檢測0.2 mg/kg的2,4-二氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)層析卡的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)變化找出最優(yōu)組合。

將羊抗鼠IgG分別稀釋成1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，利用劃膜機(jī)，劃膜于C線，用膠體金免疫層析讀數(shù)儀讀數(shù)并輔助肉眼觀測顏色，并與已優(yōu)化好的T線顏色對比，選擇出最適羊抗鼠濃度。

1.3.7 試紙條的組裝和金標(biāo)微孔的制備

免疫層析卡包括樣品墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙和PVC 底板，檢測線和質(zhì)控線分別為包被抗原和羊抗鼠IgG 抗體。金標(biāo)抗體用量按照上述優(yōu)化后的條件加入96 孔板的微孔，振蕩均勻37 ℃烘干過夜，密封干燥保存。

1.3.8 測定步驟及結(jié)果判定

吸取100 μL緩沖液于金標(biāo)微孔內(nèi)，室溫孵育8 min后，將試紙條垂直插入微孔，反應(yīng)6 min。裸眼觀察判斷：T 線和C 線顯色相近或T線大于C線時時，結(jié)果均判定為陰性；T線不顯色或顏色稍淺于C線時，結(jié)果判定陽性或弱陽性；C線無色，試紙條判定為失效(圖2)。

圖2 微孔側(cè)流免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)原理示意圖Fig.2 Structure and principle of the microwell lateral flow immunochromatography strip

1.3.9 樣品前處理

將待測的芒果、豆芽等蔬菜水果切成碎片，置于打碎機(jī)中打碎，分析天平稱取10 g 樣品置于50 mL離心管中, 加入20 mL的乙腈, 漩渦振蕩渦旋3～5 min充分混合，渦旋儀將固液混合物充分混勻, 室溫10 000 r/min 離心5 min；取1 mL上清液至10 mL潔凈干燥玻璃管中，水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加? mL復(fù)溶工作液，渦旋振蕩1 min，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

利用紫外光譜，分別掃描人工抗原、載體蛋白和2,4-二氯苯氧乙酸，如圖3所示。從掃描結(jié)果分析，與載體蛋白和2,4-二氯苯氧乙酸相比，人工抗原的特征吸收峰位移或峰型發(fā)生一定變化，表明2,4-二氯苯氧乙酸共價偶聯(lián)至載體蛋白表面。通過競爭抑制實(shí)驗(yàn)，表明抗血清對藥物和包被抗原有特異性識別反應(yīng)，證明人工抗原合成成功，從而獲得了特異性抗體。

a-免疫原；b-包被原圖3 人工抗原的紫外光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of artificial antigens

2.2 納米金的制備

制備的膠體金溶液澄清無沉淀，顏色呈酒紅色；通過紫外掃描發(fā)現(xiàn)，膠體金溶液在521 nm附近存在特征吸收峰，峰形越窄顆粒越均勻(圖4)。

圖4 膠體金溶液紫外掃描圖Fig.4 Absorption spectrum image of synthesized gold nanoparticles

2.3 標(biāo)記溶液pH的選擇

利用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)納米金溶液的pH 值分別為7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，通過觀察及紫外掃描溶液在521 nm處的吸光值選擇最適的pH值，如圖5-a所示。隨著標(biāo)記溶液pH值增大，其吸光值先增大后減小。當(dāng)溶液的pH值為8.5時，膠體金的顏色最為鮮艷、明亮，吸光值也達(dá)到最大。

2.4 標(biāo)記抗體濃度的選擇

將原始質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的抗體在1 mL的膠體金溶液中分別加入不同體積(2、4、6、8、10 μL)來優(yōu)化標(biāo)記過程中抗體用量，如圖5-b所示。當(dāng)標(biāo)記用抗體逐漸增加時，標(biāo)記抗體后納米金溶液由藍(lán)紫色逐漸變?yōu)榫萍t色，且離心后沉淀易復(fù)溶，溶液的吸光值則先增大后減小。在加入6 μL時，膠體金上清顏色和沉淀復(fù)溶效果最好，因此8 μL/mL為標(biāo)記抗體的最佳用量，即40 μg/mL。

a-pH 值；b-抗體濃度圖5 AuNPs 溶液pH 值及抗體濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of pH value of AuNPs solutionand concentration of antibody

2.5 金標(biāo)抗體用量和包被原濃度的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.3.4的棋盤方法優(yōu)化得到的結(jié)果如表1所示，不論是檢測陰性和200 ng/mL 2，4-二氯苯氧乙酸，隨著稀釋倍數(shù)的增加，層析卡T線顏色逐漸變淺。當(dāng)金標(biāo)抗體稀釋3倍、包被抗原稀釋2倍時，此時試紙條的陰性和陽性T線對比最明顯，不會存在金標(biāo)抗體過剩或不足的現(xiàn)象，因此選擇金標(biāo)抗體稀釋3倍、包被抗原稀釋2倍(1 mg/mL)。

表1 金標(biāo)抗體與包被原濃度的棋盤優(yōu)化Table 1 Chessboard optimization of concentration of gold labeled antibody and coating antigen

2.6 C線二抗質(zhì)量濃度選擇

將羊抗鼠IgG分別稀釋成1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，劃膜機(jī)劃出C線，搭配已經(jīng)選擇好的金標(biāo)抗體的量和包被抗原的質(zhì)量濃度，檢測陰性樣品(0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液)，對比T線和C線的比值(T/C)在約≤1的時候較為合適，結(jié)果如圖6所示，二抗質(zhì)量濃度在2.0 mg/mL時最佳。

圖6 質(zhì)控線二抗?jié)舛葍?yōu)化Fig.6 Optimization of the concentration of goat anti-mouse

2.7 方法的檢測限及特異性

把經(jīng)HPLC確定的陰性的水果樣品溶液，加入1 mg/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸等結(jié)構(gòu)類似物，使2,4-二氯苯氧乙酸的終質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL，4-氯苯氧乙酸的終質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸的終質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6 μg/mL。按照最優(yōu)條件進(jìn)行層析卡檢測。通過觀察T線和C線，判定結(jié)果的陰陽性。同時檢測2,4-二氯苯氧乙酸結(jié)構(gòu)類似物，計(jì)算交叉反應(yīng)率，判斷mwLFIA方法的特異性。結(jié)果如圖7和表2所示，mwLFIA方法的檢測限(消線值)為0.05 μg/mL，其結(jié)構(gòu)類似物 4-氯苯氧乙酸為0.2 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸為0.5 μg/mL，同時具有檢測時間短、操作簡單、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

表2 mwLFIA方法的檢測限及特異性Table 2 Limit of detection and specificity of mwLFIA

圖7 mwLFIA方法的檢測限及特異性Fig.7 Limit of detection and specificity of mwLFIA

2.8 實(shí)際樣品分析

分別向陰性的芒果中，添加2,4-二氯苯氧乙酸，使添加質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.25 μg/mL，同時按照確定好的樣品前處理方法處理在周邊不同商店購買的番茄(S1、S2)、豆芽(S3、S4)、芒果(S5、S6)和柑橘(S7、S8)等未知樣品，使用mwLFIA和HPLC同時測定。在標(biāo)準(zhǔn)品的添加實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)HPLC確證，mwLFIA的靈敏度未受影響，為0.05 μg/mL。mwLFIA對實(shí)際未知樣品檢測陰陽性符合率與HPLC的結(jié)果一致，結(jié)果如表3和圖8所示，說明本研究建立的針對2,4-二氯苯氧乙酸的mwLFIA方法能夠用于實(shí)際樣品的檢測。

表3 mwLFIA實(shí)際樣品分析結(jié)果Table 3 The determination results for sample by mwLFIA and HPLC

圖8 mwLFIA實(shí)際樣品分析結(jié)果Fig.8 The determination results for sample by mwLFIA and HPLC

3 結(jié)論

本研究制備了識別2,4-二氯苯氧乙酸的特異性抗體，建立了蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸殘留檢測的mwLFIA 方法,并且能夠同時檢測其結(jié)構(gòu)類似物，其中2,4-二氯苯氧乙酸的消線值為0.05 μg/mL，4-氯苯氧乙酸的消線值為0.2 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸的消線值為0.5 μg/mL，實(shí)際樣品的分析檢測結(jié)果與與HPLC法檢測結(jié)果一致。本方法前處理簡單，靈敏快速，適用于蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸殘留現(xiàn)場快速篩查。