張曼，鐘濤，魏雪，闞建全，武運，F(xiàn)ERENC Hegyi，杜木英*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(中匈食品科學(xué)合作研究中心，重慶，400715)3(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊，830052)4(匈牙利國家農(nóng)業(yè)研究和創(chuàng)新中心食品科學(xué)研究所，匈牙利 布達佩斯，H-1022)

脆紅李是中國李選育的晚熟品種，主要種植于西南地區(qū)[1]。脆紅李口感爽脆，營養(yǎng)豐富，酚類物質(zhì)含量高，具有較強的抗氧化作用[2]。果酒是近年來水果精深加工的主要方向之一，具有酒精含量低、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)價值高等特點，深受消費者的青睞。果酒的口感和香氣與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)密不可分[3]。

目前市面上尚無李子專用釀酒酵母，李子酒多采用商業(yè)釀酒酵母釀造。在使用商業(yè)釀酒酵母的同時會給李子酒帶來風(fēng)味同質(zhì)化、果香不突出、缺乏典型性等問題[4]，從而導(dǎo)致產(chǎn)品經(jīng)濟效益下降。越來越多的研究表明采用非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)與釀酒酵母混合發(fā)酵能夠豐富果酒香氣，提高果酒品質(zhì)。LI等[5]發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)與S.cerevisiae混合發(fā)酵樹莓酒，能夠增加揮發(fā)性酯類、萜類和酮類物質(zhì)；尤雅等[6]發(fā)現(xiàn)扁平云假絲酵母(Candidahumilis)與S.cerevisiae混合發(fā)酵葡萄酒，不僅降低了乙醇含量還能提高β-大馬士酮的含量。目前，混合發(fā)酵的研究對象多集中在葡萄酒，而關(guān)于其在李子酒方面的研究鮮少。劉曉柱等[7]發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)與S.cerevisiae混合發(fā)酵空心李果酒，能夠降低果酒總酸,但對酒體香氣提升不明顯。因此，篩選出適宜的非釀酒酵母與S.cerevisiae混合發(fā)酵對脆紅李果酒的開發(fā)具有積極意義。

本文比較分析了4株常見非釀酒酵母包括熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、東方伊薩酵母(Issatchenkioorientalis)、美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)與商業(yè)釀酒酵母D254混合發(fā)酵的脆紅李酒在發(fā)酵速率、理化指標(biāo)、有機酸、揮發(fā)性成分及感官品質(zhì)的差異，以期為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)脆紅李酒提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為脆紅李，2020年9月購于本地超市。將脆紅李洗凈后打漿，經(jīng)雙層無菌紗布過濾后放置于-20 ℃冰箱保藏備用。使用前在室溫下自然解凍，解凍后的脆紅李汁基本化學(xué)成分為初始糖度10.9 °Brix，總酸(以蘋果酸計)6.58 g/L，pH 3.34。

菌株：熱帶假絲酵母(C.tropicalis，CICC 31006)、東方伊薩酵母(I.orientalis，CICC 32163)、美極梅奇酵母(M.pulcherrima，CICC 32434)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)，本實驗室保存；商業(yè)釀酒酵母D254，法國Lallemand公司。

蔗糖(食品級)，市購；YPD培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉(分析純)，成都科龍化工試劑廠；有機酸標(biāo)準品，索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、2-辛醇標(biāo)準品，上海阿拉丁生化股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PH-100筆式酸度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-1240紫外分光光度計、GC2010氣相色譜儀、LC-20A高效液相色譜儀、GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混菌發(fā)酵試驗

脆紅李汁解凍后，添加蔗糖調(diào)整其初始糖度為20 °Brix，然后進行巴氏滅菌(70 ℃，15 min)，檢驗滅菌效果[8]。提前將發(fā)酵菌株接種于YPD培養(yǎng)基中活化，經(jīng)搖床培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min) 24 h后離心收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌2次后接入100 mL脆紅李汁中。非釀酒酵母接種量為107CFU/mL，釀酒酵母的接種量為106CFU/mL，接種方式為順序接種，即先接種非釀酒酵母，48 h后再接種釀酒酵母，以釀酒酵母單獨發(fā)酵為對照。發(fā)酵在帶橡膠塞和立式發(fā)酵栓的250 mL 錐形瓶中進行，(20±1)℃下靜置發(fā)酵。通過每天測定CO2失重量監(jiān)測發(fā)酵進程[9]。主發(fā)酵結(jié)束后加入50 mg/L SO2，經(jīng)8 000 r/min，10 min離心后棄菌體，上清液用于后續(xù)分析。

1.3.2 基本理化指標(biāo)測定

pH采用pH計測定；酒精度、總酸、揮發(fā)酸參照GB/T 15038—2006測定，其中酒精度采用氣相色譜法[10]測定，總酸和揮發(fā)酸采用氫氧化鈉滴定法測定；還原糖采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[11]；色度和色調(diào)采用比色法[12]，色度=A420nm+A520nm+A620nm，色調(diào)=A420nm/A520nm。

1.3.3 有機酸含量測定

有機酸的測定參照李玉珠等[13]的方法。

1.3.4 揮發(fā)性成分測定

揮發(fā)性成分測定參考LU等[14]的方法。

1.3.5 感官分析

采用定量描述分析法對脆紅李酒的香氣成分進行評價。8位經(jīng)過培訓(xùn)的感官品評員(4男4女)依次根據(jù)經(jīng)前期討論確定的感官描述詞(果香、花香、乙醇味、脂肪味、酸味)按照5點標(biāo)度法對酒樣進行打分，0～5分表示感覺強烈程度逐漸增大。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan檢驗進行多重比較。分別采用Origin 2018和SMICA 14.0進行繪圖和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵動力學(xué)曲線

如圖1所示，釀酒酵母單獨發(fā)酵的發(fā)酵速率比與非釀酒酵母混合發(fā)酵的速率更快，對照組Sc在第10天完成主發(fā)酵過程，而實驗組需要12～13 d才能完成主發(fā)酵過程，延緩了發(fā)酵進程，這是非釀酒酵母的發(fā)酵能力相對較弱的體現(xiàn)[15]。在初始發(fā)酵階段(前2 d)Sc起酵速度更快，其次是C.tropicalis和I.orientalis，而M.pulcherrima和H.uvarum相對較慢。非釀酒酵母單獨發(fā)酵48 h后接種釀酒酵母，其發(fā)酵速率明顯上升，說明Sc在酒精發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用。發(fā)酵結(jié)束后，對照組Sc釋放9.63 g CO2，混合發(fā)酵實驗組釋放8.63～9.18 g CO2，其中Hu-Sc釋放的最多。

圖1 發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.1 Fermentation kinetics (CO2production) of the mixed and pure fermentations

2.2 混合發(fā)酵對脆紅李酒理化指標(biāo)的影響

由表1可知，發(fā)酵結(jié)束后，各酒樣酒精度分別下降了6.77%、7.31%、4.11%、3.05%，可能是非釀酒酵母消耗了部分糖用于風(fēng)味物質(zhì)形成[16]。各酒樣揮發(fā)酸均符合GB 15037—2006規(guī)定(<1.2 g/L)，其中Io-Sc揮發(fā)酸含量相對較高，說明該株I.orientalis產(chǎn)揮發(fā)酸的能力較強，張文文等[17]也曾發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。顏色是脆紅李酒的重要感官品質(zhì)之一，與消費者的接受程度密切相關(guān)[18]。除Mp-Sc外，其余混合發(fā)酵酒樣的色度和色調(diào)與對照組均存在顯著性差異，說明混合發(fā)酵能夠顯著影響果酒顏色。Mp-Sc中紅色成分(A520nm)含量較高，可能是由于M.pulcherrima能夠促進紅葡萄酒色素的穩(wěn)定[19]，也可能是因為該株M.pulcherrima能夠產(chǎn)生紅色色素。

表1 脆紅李酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Physio-chemical indicators of Cuihongli plum wines

2.3 混合發(fā)酵對脆紅李酒有機酸的影響

有機酸的種類和含量是影響脆紅李酒風(fēng)味品質(zhì)的重要因素。與Sc單獨發(fā)酵相比，混合發(fā)酵對脆紅李酒中大多有機酸影響顯著，且不同菌株之間存在差異。混合發(fā)酵后脆紅李酒中的蘋果酸含量顯著降低，表明4株非釀酒酵母均具有良好的蘋果酸降解能力[20-21]，其中Io-Sc下降幅度最大，蘋果酸降解率達到35.1%。蘋果酸含量的減少有利于削弱尖銳的生青味和澀味[22]。乳酸含量也顯著降低，適量乳酸能賦予酒體酸度柔和、圓潤，更利于酒體的穩(wěn)定[23]。一般認為乙酸含量在0.20～0.70 g/L能夠增加果酒風(fēng)味復(fù)雜性，超過0.80 g/L則會帶來苦味和醋酸味。Hu-Sc與Sc的琥珀酸含量無明顯差異，這與WEI等[24]報道H.uvarum能夠降低琥珀酸的結(jié)論不一致，可能與實驗原料和所用菌株有關(guān)。酒石酸和檸檬酸變化不顯著。

表2 脆紅李酒中有機酸含量 單位：g/L

2.4 混合發(fā)酵對脆紅李酒揮發(fā)性成分的影響

如表3所示，主發(fā)酵階段結(jié)束后從脆紅李酒中共檢測到28種揮發(fā)性成分，包括8種醇類、10種酯類、5種酸類、2種萜烯類以及3種其他物質(zhì)。與Sc組(16種)相比，混合發(fā)酵(23、18、20、19種)獲得的香氣成分種類更多，說明發(fā)酵時間的延長能夠?qū)Υ嗉t李酒的風(fēng)味多樣性發(fā)揮積極作用。

表3 脆紅李酒中揮發(fā)性成分的含量Table 3 Contents of volatile components in Cuihongli plum wines

高級醇是酒精發(fā)酵階段形成的主要副產(chǎn)物之一，當(dāng)其含量低于300 mg/L時能夠增加果酒香氣復(fù)雜性[25]。在脆紅李酒的香氣組成中，醇類化合物含量最高，從5種脆紅李酒中分別檢測到8、5、6、6、5種高級醇，其中Ct-Sc組高級醇含量最高，其余樣品中高級醇的含量均低于Sc組。與對照組相比，混合發(fā)酵脆紅李酒的異丁醇含量顯著增加(除Io-Sc外)，但未達到其感覺閾值，所以不會增加果酒的生青味。異戊醇是脆紅李酒中含量最高的醇類物質(zhì)，能夠賦予酒樣白蘭地或辛辣味，但超過一定范圍后也會對脆紅李酒的風(fēng)味有不良影響。在Mp-Sc組中，苯乙醇和(E)-3-己烯-1-醇的含量顯著增加，增幅分別達到12.40%和119.00%。苯乙醇能夠為脆紅李酒帶來玫瑰、蜂蜜等香氣，(E)-3-己烯-1-醇能夠為脆紅李酒帶來青草香。

酯類物質(zhì)是果酒特征香氣成分之一，通?？梢再x予葡萄酒一定的花香、果香。5種脆紅李酒的酯類物質(zhì)種類分別為9、6、8、9和7種，其中Io-Sc酯類含量最高，達到2 255.61 μg/L，乙酸乙酯是該樣品最主要的酯類物質(zhì)，占比超過90.00%，并且僅有乙酸己酯的香氣活度值(odor activity value，OAV)>1，可推斷該酒樣香氣在組成上不協(xié)調(diào)。主發(fā)酵結(jié)束后，各實驗組的酯類含量分別是對照組的1.22、4.12、3.59、1.81倍。具體體現(xiàn)在乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯的含量顯著提升，其中辛酸乙酯(花香、香蕉)、癸酸乙酯(果香、花香)、月桂酸乙酯(脂肪、果香)的OAV>1，對脆紅李香氣貢獻更為顯著。

果酒中的脂肪酸主要來源于酵母菌和乳酸菌代謝，低濃度時散發(fā)奶酪、奶油的風(fēng)味，濃度過高則會帶來醋酸味、刺激味和腐敗味[26]。在本實驗中共檢測到5種酸類，其中乙酸和辛酸為共有成分，乙酸的產(chǎn)生與維持細胞內(nèi)氧化還原平衡密切相關(guān)[27]，辛酸是酵母發(fā)酵過程中合成細胞膜所需長鏈脂肪酸的剩余片段[28]。2-甲基丁酸僅在Io-Sc組被檢出，且其含量超過閾值(OAV>1)，會帶來酸味、干酪等不良氣味?？傮w而言，混合發(fā)酵后，酸類物質(zhì)總量顯著降低，其帶來的不良影響降低，更有利于脆紅李酒香氣的平衡。

萜烯類化合物香味濃郁，感官閾值低，對果酒香氣成分的有較大貢獻。在Sc與Hu-Sc2組中未檢測到萜烯類物質(zhì)，其余樣品中均含有芳樟醇，且在Ct-Sc和Mp-Sc2組中芳樟醇OAV>1，能夠明顯賦予脆紅李酒花香。這一結(jié)果表明C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima3種菌株可能具有相對較高的糖苷酶活性，能夠讓以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在的香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)。除此之外，Ct-Sc中還檢測到香茅醇，可為脆紅李果酒提供玫瑰花香和甜香。

在酒樣中還檢測到了2,4-二叔丁基、3-甲硫基丙醇、1-庚烯，對豐富脆紅李果酒風(fēng)味的復(fù)雜性有一定的貢獻?；炀l(fā)酵后，帶有生土豆味、脂肪味的3-甲硫基丙醇含量明顯減少。

2.5 主成分分析

一般認為，OAV>1的香氣物質(zhì)是果酒的主要呈香物質(zhì)。近年來，也有研究表明OAV>0.1 的香氣物質(zhì)可作為潛在呈香物質(zhì)，它們可以通過疊加與其類似的香氣化合物從而對果酒香氣產(chǎn)生積極效果[29]。為了直觀分析4種不同混合發(fā)酵脆紅李酒的香氣差異，對表3中OAV>0.1的12種香氣成分進行主成分分析。由圖2可知，前2個主成分累計方差貢獻率>80.00%，包含了原樣本中絕大多數(shù)信息。由(圖2-a)可知，5種脆紅李酒在置信區(qū)間內(nèi)區(qū)分明顯，且混合發(fā)酵與對照組Sc都不在同一象限內(nèi)，說明混合發(fā)酵能夠顯著影響脆紅李酒的風(fēng)味。Ct-Sc與Hu-Sc位于同一象限且距離較近，說明在風(fēng)味上具有一定的相似性， 與二者相關(guān)性強的揮發(fā)性成分是異戊醇。與Io-Sc相關(guān)性較強的揮發(fā)性成分是2-甲基丁醇和乙酸乙酯。與Mp-Sc組相關(guān)性強的揮發(fā)性成分主要包括了辛酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇等，賦予脆紅李酒果香和花香。而Sc組與辛酸、2,4-叔丁基苯酚、棕櫚酸乙酯等的相關(guān)性較強，在增加風(fēng)味多樣性的同時也帶來了不良風(fēng)味。

a-主成分得分圖；b-載荷圖圖2 酒樣中OAV>0.1的香氣化合物的主成分得分圖 和載荷圖Fig.2 PCA score map and load map of volatile aroma compounds (OAV>0.1) in wine samples

2.6 感官評價

不同混合發(fā)酵的脆紅李酒感官評價雷達圖見圖3。由圖3可知，Mp-Sc組的果香和花香得分明顯高于Sc組，這是因為M.pulcherrima與S.cerevisiae混合發(fā)酵后顯著增加了脆紅李酒中酯類物質(zhì)和萜烯類物質(zhì)的含量，可賦予果酒香氣多樣性和復(fù)雜性。Io-Sc組總酯含量最高，但其體現(xiàn)出的果香相對較弱，這與混合酯間的組成比例密切相關(guān)[30]。Ct-Sc與Hu-Sc各項評分都較為接近，與主成分分析結(jié)果一致。在本次實驗中，Ct-Sc、Hu-Sc的感官得分較低，可能與菌株接種量、接種比例、接種順序等釀造條件有關(guān)，導(dǎo)致給脆紅李酒風(fēng)味造成負面影響?？傮w來看，采用Mp-Sc混合發(fā)酵脆紅李酒時酒體具有較好的感官品質(zhì)。

圖3 感官分析雷達圖Fig.3 Radar map of sensory analysis

3 結(jié)論

本實驗研究了C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima、H.uvarum分別與Sc順序接種混合發(fā)酵對脆紅李酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與Sc單獨發(fā)酵(10 d) 相比，混合發(fā)酵延緩了發(fā)酵進程(12～13 d)。不同脆紅李酒的基本理化均符合國標(biāo)，但Io-Sc中揮發(fā)酸含量較高，達到0.78 g/L。除Mp-Sc外，混合發(fā)酵對脆紅李酒的色度和色調(diào)有顯著影響。經(jīng)混合發(fā)酵后脆紅李酒中的蘋果酸、乳酸和乙酸含量顯著降低，有利于果酒風(fēng)味平衡。在香氣方面，Mp-Sc中辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇顯著提高，有利于增強酒體果香、花香。感官評價結(jié)果表明Mp-Sc的果香味和花香味較為濃郁，而Ct-Sc與Hu-Sc風(fēng)味相對較弱，可能與釀造條件有關(guān)。綜上，M.pulcherrima更適合應(yīng)用于混菌釀造脆紅李酒，有利于增加香氣復(fù)雜性，提升品質(zhì)。后續(xù)課題組將會進一步對接種量、接種比例、接種順序等工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的脆紅李酒提供參考依據(jù)。