高偉城，王小平，沈曉華，何麗珊，柯慶輝

漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000

干姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖，能溫中散寒、回陽(yáng)通脈、溫肺化飲[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版收載炮制方法有趁鮮切片曬干或低溫干燥(干姜片)、炒炭(姜炭)、砂燙(炮姜)[1]。歷代炮制方法還有炒干姜(炒黃、土炒、麩炒)、蜜干姜、鹽干姜3種方法，其中土炒干姜首載于《類編朱氏集驗(yàn)方》[2]，收載于《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》1998年版[3]。

不同炮制方法對(duì)干姜的化學(xué)成分產(chǎn)生不同影響，臨床療效大有不同，如炮姜溫中散寒、溫經(jīng)止血，姜炭溫經(jīng)化瘀止血，土炒干姜祛寒止瀉[3]。因此，很有必要對(duì)干姜的不同炮制品質(zhì)量進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)生品干姜、清炒干姜、土炒干姜、炮姜及姜炭等不同炮制品中所含化學(xué)成分進(jìn)行差異分析比較，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)、臨床安全用藥的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀；Mettler-Toledo HS153型電子分析天平、Mettler-Toledo XSE205DU型電子分析天平；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FST-Ⅲ-10 型精密型超純水機(jī)(上海富詩(shī)特環(huán)?？萍加邢薰?；H1650R型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 試藥

干姜生品購(gòu)自江西藥都堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：四川，批號(hào)：20180801，經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院中藥教研室王小平教授鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖。不同干姜炮制品樣品信息見(jiàn)表1。

表1 不同干姜炮制品樣品信息

對(duì)照品6-姜酚(批號(hào)：MUST-19080704)、8-姜酚(批號(hào)：MUST-19032804)、10-姜酚(批號(hào)：MUST-19063004)、6-姜烯酚(批號(hào)：MUST-19032101)均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于99%；乙腈為色譜純；甲醇、磷酸試劑為分析純；水為自制超純水。

1.3 炮制樣品制備

見(jiàn)表2。

表2 不同干姜炮制品的炮制方法及制備依據(jù)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脫(0～6 min，5%～15%B；6～10 min，15%～20%B；10～15 min，20%～25%B；15～18 min，25%～28%B；18～20 min，28%～30%B；20～23 min，30%～38%B；23～35 min，38%～45%B；35～40 min，45%～60%B；40～43 min，60%～65%B；43～50 min，65%～70%B；50～75 min，70%～80%B；75～85 min，80%～90%B；85～90 min，90%～93%B；90～96 min，93%～95%B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)以6-姜酚計(jì)，不低于4000。

2.2 溶液的配制

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取適量的6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚對(duì)照品，置25 mL量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，制成分別含6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚53.50、22.50、56.75、69.25 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液的制備 分別取不同干姜炮制品適量，粉碎過(guò)50目篩，各稱取約粉末0.5 g，置具塞錐形瓶，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱質(zhì)量，

超聲提取40 min(頻率：40 kHz，功率：250 W)，取出，放冷，再稱質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，提取液13 000 r·min-1(離心半徑為63 mm)離心10 min，濾過(guò)，得續(xù)濾液，搖勻，備用。

2.3 樣品測(cè)定

分別吸取混合對(duì)照品溶液與不同干姜炮制品(S1-1、S2-1、S3-1、S4-1、S5-1)的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄97 min色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：R.參照物；S1-1.生品干姜；S2-1.清炒干姜；S3-1.土炒干姜；S4-1.炮姜；S5-1.姜炭；1.6-姜酚；2.8-姜酚；3.6-姜烯酚；4.10-姜酚。圖1 干姜不同炮制品HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn) 取生品干姜供試品(S1-1)溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A)進(jìn)行圖譜分析，結(jié)果各樣品相似度均大于0.99。各主要色譜峰的相對(duì)峰面積值及相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.15%～0.85%、0.22%～0.46%，表明儀器精密度良好。

(2)八達(dá)嶺野生動(dòng)物園安裝監(jiān)控?cái)z像頭共106個(gè)，東北虎園東北門、西北門各有1個(gè)監(jiān)控?cái)z像頭，運(yùn)行狀況良好。由此可見(jiàn)，假若動(dòng)物園工作人員隨時(shí)查看監(jiān)控錄像，應(yīng)該可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)的發(fā)生并且采取措施。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn) 取生品干姜(S1-2)共6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A)進(jìn)行圖譜分析，結(jié)果各樣品相似度均大于0.98。各主要色譜峰的相對(duì)峰面積值及相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別在0.31%～0.84%、0.23%～0.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取生品干姜(S1-3)供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A)進(jìn)行圖譜分析，結(jié)果各樣品相似度均大于0.98。各主要色譜峰的相對(duì)峰面積值及相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別在0.19%～0.65%、0.08%～0.29%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 不同干姜炮制品HPLC圖譜的建立

2.5.1不同干姜炮制品HPLC圖譜采集 按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備生品干姜、清炒干姜、土炒干姜、炮姜及姜炭的各5批供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，分別采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A)進(jìn)行圖譜分析，得不同干姜炮制品疊加HPLC圖譜，見(jiàn)圖2～6。

圖2 5批生品干姜HPLC圖

圖3 5批清炒干姜HPLC圖

圖4 5批土炒干姜HPLC圖

圖5 5批炮姜HPLC圖

圖6 5批姜炭HPLC圖

2.5.2不同干姜炮制品圖譜的直觀比較 將不同干姜炮制品的圖譜與混合對(duì)照品圖譜進(jìn)行直觀比較分析。不同干姜炮制品均含有6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚4個(gè)成分，且含量占比高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。6-姜酚、8-姜酚及10-姜酚色譜峰的峰面積高低順序?yàn)樯犯山⑼脸锤山?、清炒干姜、姜炭、炮姜?-姜烯酚色譜峰面積高低順序?yàn)樯犯山?、炮姜、姜炭、土炒干姜、清炒干姜。生品干姜、清炒干姜、土炒干姜與炮姜、姜炭在1、2、3、4峰有明顯的區(qū)別，提示在炮制過(guò)程中有明顯的新成分生成；其中峰1是土炒干姜、姜炭、炮姜共有，峰3是炮姜、姜炭共有，峰2、4則炮姜、姜炭峰面積明顯高于生品干姜、清炒干姜、土炒干姜。不同炮制方法對(duì)干姜的內(nèi)在化學(xué)成分的組成變化及量有影響。

2.5.3相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A)，對(duì)不同干姜炮制品進(jìn)行相似度分析。炮姜與生品干姜相比較，相似度有顯著差異、其次是姜炭、土炒干姜，見(jiàn)表3。其中，炮姜、姜炭成分組成有變化；清炒干姜、土炒干姜成分組成基本一致；不同炮制方法成分的含量均有所區(qū)別，見(jiàn)圖7。

表3 不同干姜炮制品相似度分析

注：1.tR=7.904 min；2.tR=11.36 min；3.tR=16.302 min；4.tR=25.629 min。圖7 不同干姜炮制品疊加圖譜

2.6 系統(tǒng)聚類分析(HCA)

采用SPSS 22.0分析軟件，以組之間鏈接及平方Euclidean距離方法，對(duì)25 批樣品進(jìn)行HCA[7]。結(jié)果不同干姜炮制品基本可分為4大類(圖8)，S2(S2-1～S2-5)、S3(S3-1～S3-5)聚為第一類，S1(S1-1～S1-5)聚為第二類，S4(S4-1～S4-5)聚為第三類，S5(S5-1～S5-5)聚為第四類。

圖8 不同干姜炮制品聚類譜系

2.7 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

將25 批樣品共有色譜峰峰面積信息，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進(jìn)行PLS-DA見(jiàn)圖9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25批樣品基本可分為4 組，S1(S1-1～S1-5)為第一類、S2(S2-1～S2-5)、S3(S3-1～S3-5)為第二類，S4(S4-1～S4-5)為第三類，S5(S5-1～S5-5)為第四類。與HCA結(jié)果一致。

圖9 不同干姜炮制品HCA圖

2.8 PLS-DA

圖10 不同干姜炮制品差異性變量VIP圖

2.9 6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量測(cè)定

2.9.1色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脫(0～15 min，38%～68%A；15～30 min，68%～70%A；30～40 min，70%～95%A；40～60 min，95%～92%A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃。HPLC圖見(jiàn)圖11。

注：A.混合對(duì)照品；B.生品干姜；C.清炒干姜；D.土炒干姜；E.炮姜；F.姜炭；1.6-姜酚；2.6-姜烯酚；3.10-姜酚。圖11 對(duì)照品及不同干姜炮制品的HPLC圖

2.9.2混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量的6-姜酚、6-姜烯酚及10-姜酚對(duì)照品，置10 mL量瓶中，75%甲醇定容至刻度，搖勻，制成分別含6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚107.0、113.5、138.5 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

2.9.3線性關(guān)系考察 分別精密吸混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、10 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.9.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果分別為6-姜酚：Y=534.85X-1.289 4，r=0.999 9；6-姜烯酚：Y=2 261.2X+37.021，r=0.999 7；10-姜酚：Y=477.37X+ 67.249，r=0.999 1?？芍?-姜酚在0.214～2.14 μg、6-姜烯酚在0.227～2.27 μg、10-姜酚在0.277～2.77 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.9.4精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照2.9.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得各對(duì)照品的峰面積RSD為0.15%～0.87%，表明儀器精密度良好。

2.9.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(S1-3)，按照2.9.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、24 h測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得各對(duì)照品的峰面積RSD為0.23%～1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品(S1-1)5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.9.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得各樣品的峰面積RSD為1.46%～1.92%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份已知量的樣品，每3份為1組，分別加入對(duì)照品溶液為各樣品中成分量的80%、100%、120%，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.9.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得各樣品的加樣回收率為98.46%～101.12%，RSD為0.21%～1.76%。

2.9.8不同干姜炮制品含量測(cè)定 分別取25批不同干姜炮制品樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.9.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同干姜炮制品中6-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)、流動(dòng)相和提取條件的選擇

在借鑒前人的研究結(jié)果基礎(chǔ)上[8-9]，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在280 nm基線穩(wěn)定、色譜峰較多。比較不同時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)下，不同干姜炮制品的超聲提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75%甲醇提取40 min，分離效果好，色譜峰較多。分別考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫，色譜峰信息較豐富、峰形對(duì)稱、分離度好，可為不同干姜炮制品的質(zhì)量控制提供一定參考。

3.2 不同炮制方法對(duì)干姜的化學(xué)成分的影響

通過(guò)共有峰圖譜、HCA及PCA發(fā)現(xiàn)，不同炮制方法對(duì)干姜的化學(xué)成分的組成變化有影響，其中炮姜、姜炭變化較顯著，表現(xiàn)在新成分的產(chǎn)生及峰面積的大小，這可能與加熱時(shí)間延長(zhǎng)及溫度的升高有關(guān)。

3.3 干姜不同炮制品的臨床應(yīng)用的內(nèi)在依據(jù)

金元醫(yī)家李杲云：“干姜，生辛炮苦，陽(yáng)也，生用逐寒邪而發(fā)表，炮則除胃冷而守中”[10]，表明生品干姜與其炮制品功效有明顯差異，臨床應(yīng)用有所區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)研究表明，炮制前后，土炒干姜、炮姜及姜炭有新色譜峰出現(xiàn)，這可能是干姜不同炮制品的臨床應(yīng)用不同的內(nèi)在依據(jù)。

3.4 干姜不同炮制品增加指標(biāo)性成分質(zhì)量控制

研究表明，姜酚具有舒張血管并表現(xiàn)良好的抑制血小板聚集作用[11]。本研究表明，炮姜、姜炭的姜酚含量明顯低于生品干姜、清炒干姜、土炒干姜，與其長(zhǎng)于止血相吻合。且不同干姜炮制品化學(xué)組成成分的存在差異，而成分差異主要標(biāo)記物為已確定的6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚3個(gè)藥效成分，對(duì)其臨床療效產(chǎn)生不同影響。故應(yīng)增加不同干姜炮制品中6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚等成分的含量控制，進(jìn)一步提高其安全性、有效性。