曹雪丹 方修貴 趙 凱

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州 318026）

葡萄柚(Citrus paradisiMacf.)是蕓香科柑橘屬植物，為世界柑橘四大類群(甜橙類、寬皮柑橘類、檸檬來檬類、葡萄柚和柚類)之一[1]。其果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，果實(shí)多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。經(jīng)過多年的引種栽培，已逐漸在我國(guó)形成了一些具有一定種植規(guī)模的主栽品種。據(jù)分析，每100 g全果含水分89.64 g、蛋白質(zhì) 0.89 g、脂肪 0.1 g、碳水化合物 9.5 g；鈣18mg、磷17mg、鐵 0.1mg；VB10.06mg、VB20.03mg、VC4 0mg；每升果汁含柚皮苷528～743 mg，可以形成VP，具有清熱退火的功效[2]。而且，葡萄柚汁有助于保持肝臟移植術(shù)后患者排斥抑制劑FK506的谷值濃度，提高其生物利用度[3]。對(duì)中國(guó)主栽的 9個(gè)葡萄柚品種的酚類物質(zhì)組成及其抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，葡萄柚不僅多酚含量極其豐富，而且抗氧化能力也高[4]，是具有良好開發(fā)前景的天然抗氧化劑和保健食品原料。

果醋是以水果或水果加工下腳料為主要原料，經(jīng)微生物酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀制而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良且具有抑菌，抗氧化，緩解疲勞，預(yù)防飲食型肥胖和高脂血癥等生理功能的酸性調(diào)味品[5]。我國(guó)傳統(tǒng)釀醋多采用混合菌緩慢發(fā)酵的固態(tài)工藝，生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá) 3個(gè)月，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)成本高。采用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)果醋具有易操作管理，規(guī)模化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，有利于縮短生產(chǎn)周期[6]。近年來，柑橘類果醋的研究報(bào)道大多針對(duì)菌種的篩選和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面。如：劉青娥等[7]以自然酸發(fā)酵的柑橘醋液為菌源，篩選出41株醋酸菌，其中 1株耐溫性能和耐酒精能力均優(yōu)于對(duì)照菌株滬釀 1.01；程世春[8]從水果中分離得到 1株高產(chǎn)醋酸菌株可用于常規(guī)液體發(fā)酵法釀造柑橘果醋；王彥安等[9]采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行柑橘果醋的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化，得出酒精發(fā)酵參數(shù)為：初始糖度為16%、接種量為5%、初始pH為 3.5，醋酸發(fā)酵參數(shù)為:接種量為 8.52%、初始酒精度為 6.02%、發(fā)酵pH為3.3，該工藝下醋酸產(chǎn)量53.11g/L；曹雪丹等[10]對(duì)椪柑果醋液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并經(jīng)GC-MS分析鑒定出了66種揮發(fā)性物質(zhì)。

但是，目前對(duì)液態(tài)深層法發(fā)酵葡萄柚果醋的研究并不多見。本試驗(yàn)以滬釀 1.01醋酸桿菌為研究對(duì)象，以葡萄柚為研究試材，對(duì)液態(tài)深層發(fā)酵工藝及發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期為葡萄柚及柑橘類果醋的工業(yè)化發(fā)酵提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄柚采自浙江省柑橘研究所山地試驗(yàn)站。高活性釀酒干酵母（RV171）：安琪酵母股份有限公司。醋酸菌（滬釀 1.01）：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。白砂糖，偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）等均為食品級(jí)；氫氧化鈉（NaOH）等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；聚醚砜濾膜（孔徑 0.45μm）：美國(guó)密理博公司；果膠酶（活力10萬(wàn)u/ml，液體型）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；醋酸菌分離培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

PAL- 3手持式數(shù)字折射儀（日本ATAGO公司）；MJ-176NR榨汁/攪拌機(jī)（日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）；SW-CJ- 1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZHWY-2102 C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； 5 L試驗(yàn)型自吸發(fā)酵罐（南京匯科生物工程設(shè)備有限公司）；雷磁JPB-607 A便攜式溶解氧測(cè)定儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FlveGo F2便攜式pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Heal Force HF-151二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；XK97-A菌落計(jì)數(shù)器（杭州齊威儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程。挑選大小均勻、成熟度一致的新鮮葡萄柚為原料→用自來水流水沖洗果皮后自然晾干→手工剝皮、去籽→將果肉投入榨汁機(jī)中破碎取汁→收集果汁并添加 0.5‰果膠酶，常溫（20℃）酶解→添加焦亞硫酸鈉30～50mg/L并經(jīng)100目尼龍紗網(wǎng)粗濾→添加活化后的酵母菌200～400mg/L →常溫（20℃）酒精發(fā)酵 5～ 7 d→低溫（ 8℃）靜置48 h以上→吸取上清液移入液態(tài)發(fā)酵罐，測(cè)得酒精含量為 4%，添加酵母提取物5‰、葡萄糖 8‰，升溫至36℃后接種滬釀1.01醋酸菌 4‰→調(diào)整發(fā)酵罐轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速≥1000rpm，醋酸發(fā)酵→澄清→過濾→灌裝→滅菌→成品。

1.3.2 醋酸菌分離計(jì)數(shù)。平板涂布法。稱取醋酸菌分離培養(yǎng)基55.0 g，用1000ml蒸餾水加熱溶解，分裝并于116℃高壓滅菌20min，冷卻至50℃再加入 3%無水乙醇，搖勻后倒入培養(yǎng)皿，待用。準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液 1ml，迅速在無菌環(huán)境下按梯度稀釋至109倍，每個(gè)梯度吸取 0.1ml接種至培養(yǎng)基上，并用涂布棒快速涂勻，30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后觀察培養(yǎng)基顏色的變化和菌落形態(tài)，記數(shù)。

1.3.3 溶解氧測(cè)定。參考HJ 506-2009[11]采用電化學(xué)探頭方法。

1.3.4 pH。采用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.3.5 滴定酸。采用酸堿測(cè)定法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

由圖 1可以看出，滬釀 1.01醋酸菌在葡萄柚果醋發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化具有先升高后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵初始階段，醋酸菌計(jì)數(shù)為 5.6 2 log CFU/mL，此后的48 h內(nèi)進(jìn)入快速增殖階段，醋酸菌數(shù)量最大值達(dá)10.7 3log CFU/mL，之后維持在 9.0 log CFU/mL水平并有所下降。通常情況下培養(yǎng) 1 d后為醋酸菌的增殖過程，此時(shí)酒精消耗量很小，產(chǎn)酸量并不明顯。培養(yǎng) 2 d后，醋酸菌進(jìn)入代謝旺盛階段，醋酸菌數(shù)量增加不再明顯，此時(shí)產(chǎn)酸速度加快。一般培養(yǎng) 4～ 5 d即可達(dá)到產(chǎn)酸量的最大值。

圖1 葡萄柚醋發(fā)酵過程中醋酸菌計(jì)數(shù)的變化

由圖 2可以看出，在葡萄柚果醋發(fā)酵過程中溶解氧含量的變化呈下降趨勢(shì)。在發(fā)酵24 h內(nèi)，發(fā)酵液中溶解氧含量呈急速下降的趨勢(shì)，由 8.0mg/L下降至 0.5mg/L，之后一直維持在較低水平。這可能是因?yàn)闇?1.01醋酸菌在葡萄柚果醋發(fā)酵初始階段快速增殖，需要消耗大量氧氣。至整個(gè)發(fā)酵階段，醋酸菌對(duì)氧氣的需求量一直較高，這可能是測(cè)得發(fā)酵液溶解氧含量較低的原因之一。

圖2 葡萄柚醋發(fā)酵過程中溶解氧量的變化

由圖 3可以看出，在葡萄柚果醋發(fā)酵過程中pH值呈降低趨勢(shì)。相比醋酸菌種子培養(yǎng)液（由酵母提取物 1.0%、葡萄糖 4.0%、酒精 4.0%等配制）的pH值≥ 6.5而言，葡萄柚汁的pH值較低，發(fā)酵初始階段僅為 4.0左右，可能會(huì)對(duì)醋酸菌的增殖速度和產(chǎn)酸能力造成影響。但是最終pH值降低至 3.6左右，接近一般食醋pH值 3.2～3.5水平。

圖3 葡萄柚醋發(fā)酵過程中pH值的變化

由圖 4可以看出，葡萄柚果醋發(fā)酵過程中滴定算含量呈增加的趨勢(shì)。由發(fā)酵初始階段滴定酸含量 0.5%至發(fā)酵96 h后達(dá) 2.4%。按照初始酒精度 4%計(jì)算，理論最大產(chǎn)酸量也為 4%。但是考慮深層發(fā)酵罐攪拌、通氣過程中造成約30%左右的酒精逃逸損失，實(shí)際的理論產(chǎn)酸量約為2.8%，則產(chǎn)酸率達(dá)到85.71%。提高發(fā)酵初始酒精度對(duì)產(chǎn)酸率的影響尚待進(jìn)一步研究。

圖4 葡萄柚醋發(fā)酵過程中滴定酸含量的變化

3 結(jié)論

醋酸發(fā)酵是果醋生產(chǎn)的重要階段，發(fā)酵方法的選擇決定了果醋的發(fā)酵風(fēng)味、發(fā)酵效率，而醋酸菌菌種對(duì)果醋品質(zhì)的影響較大。近年來，關(guān)于柑橘果醋發(fā)酵菌種的篩選研究時(shí)有報(bào)道，但是能否適應(yīng)液態(tài)深層發(fā)酵工藝尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滬釀 1.01醋酸菌可用于液態(tài)深層發(fā)酵法釀制葡萄柚果醋，48 h內(nèi)為該醋酸菌的快速增殖期，發(fā)酵96 hpH值為 3.6，可滴定酸含量 2.4%。但還需進(jìn)行果醋發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，為液態(tài)深層發(fā)酵柑橘類果醋的應(yīng)用研究提供一定的理論參考，以促進(jìn)柑橘果醋的工業(yè)化生產(chǎn)。