陳小霞，程齊堯，詹 磊，蔣 磊

心肌炎是心肌局限性、彌漫性的急性、慢性炎性病變，可由多種因素誘導(dǎo)發(fā)病，分為非感染性心肌炎和感染性心肌炎，病毒感染是常見(jiàn)的病因，其次是細(xì)菌、真菌、病原體等[1]。病毒性心肌炎是指病毒侵犯心肌組織引起急性、慢性心肌炎性病變，其中柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是誘發(fā)病毒性心肌炎的常見(jiàn)病毒，占30%～50%，病毒侵犯對(duì)心肌組織造成直接損傷，引起心肌細(xì)胞變性和壞死，影響心肌組織功能[2]。病毒性心肌炎目前尚無(wú)特異性治療方案，主要采取對(duì)癥治療，包括抗病毒治療、免疫治療、強(qiáng)心和利尿治療等，以減輕心臟負(fù)荷為治療原則[3]。臨床常用的β-受體阻滯劑可幫助病毒性心肌炎病人減慢心率，以達(dá)到改善病毒性心肌炎病人預(yù)后，但β-受體阻滯劑可產(chǎn)生負(fù)性肌力作用和抑制傳導(dǎo)系統(tǒng)，使用過(guò)程中可能加重病人心功能損傷[4]。伊伐布雷定屬于選擇性、特異性竇房結(jié)If通道阻滯劑，降低心律同時(shí)不影響心肌收縮力和心臟的傳導(dǎo)能力，2015年已在我國(guó)獲批上市用于心力衰竭的治療[5]。相關(guān)研究表明，伊伐布雷定在冠心病[6]、心力衰竭[7]、心絞痛[8]等疾病中表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用，有研究表明，伊伐布雷定治療病毒性心肌炎患兒的臨床療效顯著[9]，但伊伐布雷定治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)制備病毒性心肌炎大鼠模型探討伊伐布雷定對(duì)病毒性心肌炎作用機(jī)制，以期為臨床治療病毒性心肌炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(160±10)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)[SCXK(粵)2019-0047]，購(gòu)回后于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，晝/夜各12 h，全天自由飲水、進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵守“3R”原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 CVB3(武漢大學(xué)病毒研究所)，伊伐布雷定(YJ-26039R，上海雅吉生物科技有限公司)，肌紅蛋白(Mb)試劑盒(0-027530，上海江萊生物科技有限公司)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶(lactate dehydro-genase，LDH)活力檢測(cè)試劑盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，RNAprep pure細(xì)胞試劑盒與Reverse Transcriptase Kit(天根生化科技北京有限公司)，2×HSYBR qPCR Mix(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)，動(dòng)物組織DNA抽提純化試劑盒(104-201，南京萊富賽生物科技有限公司)，EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005，上海復(fù)申生物科技有限公司)，Go Taq Green Master Mix(M7122，南京賽泓瑞生物科技有限公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 SelectspinTM17R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Select BioProducts公司)，ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-rad公司)，LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)。

1.3 制備病毒性心肌炎大鼠模型 將75只SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、伊伐布雷定低劑量組、伊伐布雷定中劑量組、伊伐布雷定高劑量組，參考文獻(xiàn)[10]制備病毒性心肌炎大鼠模型，模型組和伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠腹腔注射0.1 mL 100 TCID 50與0.1 mL CVB3稀釋液，對(duì)照組注射等體積磷酸鹽緩沖液，連續(xù)注射3 d。

1.4 藥物干預(yù) 首次注射CVB3后24 h，根據(jù)伊伐布雷定臨床用藥劑量(每日5～14 mg)、成人與大鼠藥物用量折算系數(shù)(6.25)設(shè)置伊伐布雷定劑量4 mg/kg、8 mg/kg、12 mg/kg分別作為伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組干預(yù)劑量，采取灌胃方式，每日1次，對(duì)照組和模型組灌胃等體積磷酸鹽緩沖液，連續(xù)干預(yù)2周。末次給藥24 h后，股動(dòng)脈取血進(jìn)行心肌損傷標(biāo)志物水平檢測(cè)，取部分心臟組織用于蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察心肌病理結(jié)構(gòu)變化和脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，余下心臟組織用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 隨機(jī)選取6只大鼠，取股動(dòng)脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液儲(chǔ)存于-80 ℃，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)CK-MB、Mb、cTnI、LDH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5.2 HE染色檢測(cè)心肌組織病理情況 每組隨機(jī)選取6只大鼠，取心臟組織固定于10%甲醛中性溶液，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟、水化、HE染色、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片后在高倍鏡下(400倍)觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.5.3 TUNEL檢測(cè)心肌組織凋亡情況 常規(guī)石蠟包埋、切片至水化操作同1.5.2，采用蛋白酶K修復(fù)20 min，3% H2O2室溫封閉5 min，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)于37 ℃條件下反應(yīng)1 h，氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作溶液反應(yīng)30 min、0.05%二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色4 min、蘇木精復(fù)染10 min、脫水、透明、封片，顯微鏡下采集圖像。細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒是凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，在高倍鏡下(400倍)隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野，記錄視野中細(xì)胞總數(shù)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平 通過(guò)RNAprep pure細(xì)胞試劑盒提取心肌組織總RNA，Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄生成第一條cDNA鏈用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以U6作為內(nèi)參基因，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、40個(gè)循環(huán)，62 ℃ 1 min。收集熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值輸出，采用2-△△Ct公式計(jì)算Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Bcl-2：正向引物5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，反向引物5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′；Bax：正向引物5′-CAGTTGAACTTCCCATCAGC-3′，反向引物5′-CAGTTCAAGTTC CCATCAGC-3′；CytC：正向引物5′-TGATCCTTTGTCGTGTTGACCAG-3′，反向引物5′-GACCATGGAGGTTTCGTCCAGT-3′。所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5.5 MSP檢測(cè)Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化 以DNA抽提純化試劑盒提取心肌組織DNA，并通過(guò)分光光度測(cè)定DNA濃度，DNA總量取500 pg，采用無(wú)菌去離子水將DNA體積補(bǔ)足至20 μL，加入CT轉(zhuǎn)化試劑130 μL、98 ℃孵育10 min、64 ℃孵育150 min，10 μL溶解液洗脫DNA，4 ℃保存20 h。采用Methptimer軟件設(shè)計(jì)Bcl-2外引物、MSP引物，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，退火溫度51 ℃→41 ℃(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，之后再以第一次PCR產(chǎn)物作為擴(kuò)增模板，使用Bcl-2甲基化引物、非甲基化引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上。Bcl-2外引物：正向引物5′-GTTTTGTTTTTATTTATTTAGTAGTTTTT-3′，反向引物5′-AATCCTATAATATTTTCCCCTTCTC-3′；Bcl-2甲基化引物：正向引物5′-GTTTTCGTTTTCGGTTTTTTTATC-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCGAC-3′；Bcl-2非甲基化引物：正向引物5′-TTTTTGTTTTTGGTTTTTTTATTGT-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCAAC-3′。將獲得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 V，25 min)，采用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)量Bcl-2甲基化和Bcl-2非甲基化條帶的相對(duì)灰度值，將Bcl-2甲基化/非甲基化比較作為Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平比較 模型組CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平高于對(duì)照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平低于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織病理HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：模型組心肌組織存在明顯炎性浸潤(rùn)、細(xì)胞壞死；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌組織損傷較模型組得到明顯改善。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色圖像(×400)(A為對(duì)照組；B模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

2.3 伊伐布雷定對(duì)病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡的影響 模型組心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax mRNA、CytC mRNA高于對(duì)照組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA低于對(duì)照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax mRNA、CytC mRNA低于模型組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平高于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組心肌組織TUNEL圖(×400)(A為對(duì)照組；B為模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

表2 各組凋亡指數(shù)和Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相對(duì)水平比較(±s)

2.4 各組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較 MSP檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平高于對(duì)照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平低于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化電泳圖(M為甲基化；U為非甲基化；A為對(duì)照組；B為模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

表3 各組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較(±s)

3 討 論

心肌炎是伴有心肌炎癥和損傷的心臟疾病，CVB3是引起病毒性心肌炎發(fā)病的常見(jiàn)病因[11]。病毒進(jìn)入機(jī)體后，直接產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)、病理性免疫反應(yīng)或引起機(jī)體產(chǎn)生自身免疫效應(yīng)。CVB3與其受體結(jié)合后，釋放病毒蛋白酶可切割宿主細(xì)胞中的各種蛋白質(zhì)，如切割Bcl-2家族中的Bid，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。CVB3感染后通過(guò)蛋白酶體依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D切割，引起宿主細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[12]。病毒感染、心肌細(xì)胞壞死引起細(xì)胞內(nèi)抗原釋放，導(dǎo)致自身免疫性T細(xì)胞活化，加重病毒性心肌炎心肌損傷[13]。病毒性心肌炎引起心率加速，心率加速可增加心血管疾病病人死亡風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)心率加速也受到體內(nèi)炎癥嚴(yán)重程度的影響[14]。因此，病毒性心肌炎臨床治療時(shí)需給予減慢心率的藥物治療。伊伐布雷定是竇房結(jié)If電流選擇特異性抑制劑，延長(zhǎng)竇房結(jié)自動(dòng)去極化時(shí)間以緩解心率過(guò)快[15]，且對(duì)心肌收縮力和心臟傳導(dǎo)能力無(wú)影響。已有研究表明，伊伐布雷定對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有緩解作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平升高，通過(guò)伊伐布雷定干預(yù)后可降低病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平，且表現(xiàn)為劑量效應(yīng)。LDH為糖原溶解酶，組織細(xì)胞受損時(shí)，LDH含量升高。CK-MB是心肌組織損傷標(biāo)志物，其水平異常升高與心肌組織受損嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。肌鈣蛋白是分布于心肌細(xì)胞纖維上的一種調(diào)節(jié)蛋白，cTnI是肌鈣蛋白亞單位之一，正常生理狀態(tài)下cTnI以結(jié)合形式分布于肌原纖維，極少數(shù)cTnI分布于細(xì)胞胞漿，心肌細(xì)胞膜受損時(shí)cTnI通過(guò)心肌細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，此時(shí)血液cTnI含量升高[18]。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織細(xì)胞斷裂明顯、細(xì)胞排列紊亂且細(xì)胞核固縮；伊伐布雷定干預(yù)后病毒性心肌炎大鼠心肌組織細(xì)胞核固縮癥狀減輕且細(xì)胞排列較緊密，說(shuō)明CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎大鼠心肌組織存在嚴(yán)重?fù)p傷，給予伊伐布雷定干預(yù)可有效緩解病毒性心肌炎大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果還顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，給予伊伐布雷定干預(yù)可降低心肌組織凋亡指數(shù)，說(shuō)明伊伐布雷定可減少病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡。細(xì)胞凋亡是病毒性心肌炎性細(xì)胞死亡的作用機(jī)制之一，病毒性心肌炎急性期，心肌組織存在細(xì)胞凋亡，這些凋亡細(xì)胞主要是浸潤(rùn)于局部心肌組織的炎性細(xì)胞，隨著病毒性心肌炎病情進(jìn)展，心肌細(xì)胞和心肌纖維化細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要有3種途徑，包括線(xiàn)粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑。Bcl-2主要分布于線(xiàn)粒體膜外，具有調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜通透性作用，Bax是線(xiàn)粒體膜成分之一，Bax表達(dá)上調(diào)促進(jìn)CytC穿過(guò)線(xiàn)粒體膜進(jìn)入胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族在線(xiàn)粒體外膜通道形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中促凋亡蛋白Bax可在線(xiàn)粒體外膜產(chǎn)生釋放孔道，有助于膜間隙中的可溶性蛋白經(jīng)過(guò)此孔道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，正常生理狀態(tài)下不影響線(xiàn)粒體內(nèi)膜功能和基質(zhì)功能[20]。受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Bax構(gòu)象發(fā)生變化并寡聚在線(xiàn)粒體膜上，形成較大孔道，將CytC從線(xiàn)粒體中釋放，Bcl-2可降低線(xiàn)粒體膜通透性，抑制CytC釋放[21]。CytC是電子傳遞鏈復(fù)合體中的組成部分之一，具有傳遞電子作用，定位于線(xiàn)粒體膜間隙，電穩(wěn)定性結(jié)合于線(xiàn)粒體膜，受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，經(jīng)孔道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，之后在系列作用下形成凋亡體，活化Caspase途徑，促進(jìn)凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織Bax mRNA、CytC mRNA、Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平升高，給予伊伐布雷定干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，而B(niǎo)cl-2 mRNA水平降低。啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，通過(guò)調(diào)控基因的甲基化可調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23]。高等生物中DNA甲基化必須在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下將甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5C上，使其產(chǎn)生5甲基胞嘧啶。本研究結(jié)果顯示，伊伐布雷定對(duì)病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡的改善作用可能與調(diào)節(jié)CytC mRNA、Bax mRNA水平有關(guān)，還可能通過(guò)降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平，進(jìn)而提高Bcl-2 mRNA水平，影響線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡指數(shù)。

綜上所述，伊伐布雷定對(duì)CVB3誘導(dǎo)發(fā)生的病毒性心肌炎大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡具有緩解作用，可降低心肌組織細(xì)胞Bax mRNA、CytC mRNA水平，提高Bcl-2 mRNA水平，可能與降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織細(xì)胞Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平有關(guān)，但具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。