馮應(yīng)華

許昌市第五人民醫(yī)院，河南 許昌 461100

糖尿病與心腦血管疾病、惡性腫瘤已成為威脅人類生命健康的主要影響疾病并具有顯著的老年化趨勢(shì)，發(fā)病率和死亡率逐年升高［1］。糖尿病多見(jiàn)微血管并發(fā)病變，以糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）發(fā)生率最高，嚴(yán)重降低了患者正常視力，亦是臨床致盲的重要原因［2］。對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變具體發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明晰，多認(rèn)為是視網(wǎng)膜微血管病變損傷誘發(fā)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及加工主要場(chǎng)所之一，細(xì)胞受到外部刺激后由于內(nèi)部的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程，可誘發(fā)一系列病理生理過(guò)程并有研究［3］提示糖尿病視網(wǎng)膜病變可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)蛋白的異常凋亡存在關(guān)系。因此，本研究以內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP為研究重點(diǎn)，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清PERK、CHOP和IRE水平及意義進(jìn)行了深入探討，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年8月在許昌市第五人民醫(yī)院治療的糖尿病患者210例，其中有糖尿病視網(wǎng)膜病變患者60例（DR組），其中非增殖期視網(wǎng)膜病變（NPDR）患者34例，增期期視網(wǎng)膜病變（PDR）患者26例，無(wú)視網(wǎng)膜病變患者150例（DM組），同時(shí)選取健康者100例作為對(duì)照組，DR組、DM組和對(duì)照組受試者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：（1）糖尿病診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)；（2）DR診斷符合2014年國(guó)際眼科理事會(huì)糖尿病眼部保健指南中的標(biāo)準(zhǔn)，視網(wǎng)膜病變經(jīng)直接眼底鏡檢查或眼底熒光血管造影確診；（3）患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有高血壓、惡性腫瘤、肝腎功能障礙、HIV感染等其他嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾??；（2）有青光眼、白內(nèi)障等眼部疾病；（3）1型糖尿病，見(jiàn)表1。

表1 DR組、DM組和對(duì)照組一般資料比較

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜中PERK、CHOP和IRE表達(dá)。組織勻漿法提取視網(wǎng)膜組織總蛋白；取50 ug總蛋白SDS-PAGE裂解后轉(zhuǎn)膜，牛血清蛋白（30 g/L）2 h封閉、分別加入兔抗大鼠PERK、CHOP和IRE一抗，4℃孵育后加入辣根化得IgG二抗，暗室條件下曝光顯影［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組組織PERK、CHOP和IRE表達(dá)水平

DR組組織PERK和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和DM組（P＜0.05）；DR組組織CHOP相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而與DM組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DM組組織PERK、CHOP和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組血清PERK、CHOP和IRE表達(dá)水平（±s)

注：a與對(duì)照組比較P＜0.05；b與DM組比較P＜0.05

組別對(duì)照組（n=100）DM組（n=150）DR組（n=60）FP PERK相對(duì)表達(dá)量0.412±0.098 1.022±0.103a 1.382±0.112ab 10.022＜0.050 CHOP相對(duì)表達(dá)量0.202±0.091 1.021±0.101a 1.011±0.110a 11.287＜0.050 IRE相對(duì)表達(dá)量0.312±0.110 0.570±0.102a 0.880±0.102ab 12.281＜0.050

2.2 DR組不同分型患者組織PERK、CHOP和IRE表達(dá)水平

DR組PDR患者組織PERK和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于NPDR患者（P＜0.05）；DR組NPDR和PDR患者CHOP相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 DR組不同分型患者血清PERK、CHOP和IRE表達(dá)水平（±s)

分型NPDR（n=34)PDR（n=26)tP PERK相對(duì)表達(dá)量1.300±0.108 1.404±0.110-3.667＜0.050 CHOP相對(duì)表達(dá)量1.004±0.102 1.014±0.101-0.378＞0.050 IRE相對(duì)表達(dá)量0.821±0.103 0.922±0.104-3.748＜0.050

2.3 相關(guān)性分析

將DR患者組織PERK、CHOP和IRE表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：DR患者PERK和IRE呈正相關(guān)（r=0.402，P＜0.05）；CHOP與PERK、IRE無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

糖尿病患者由于持續(xù)維持在高血糖及長(zhǎng)期血糖不穩(wěn)，誘發(fā)血小板凝集力升高，損傷微細(xì)血管，誘發(fā)微細(xì)血管局部膨大、水腫、滲漏、出血及阻塞等癥狀，而微細(xì)血管阻塞后由于視網(wǎng)膜缺氧致使視網(wǎng)膜血管大量增生并伴隨纖維增生，最終導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變［6-7］。研究［8］提示糖尿病視網(wǎng)膜病變的疾病進(jìn)展后可造成黃斑部水腫而降低視力，玻璃體出血后還可造成突發(fā)性模糊，嚴(yán)重患者甚至出現(xiàn)視網(wǎng)膜剝離及新生血管性青光眼造成視力下降，但現(xiàn)階段的本病的具體機(jī)制尚不明晰。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要條件，但受到外界的強(qiáng)烈刺激后極易誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工、合成及修飾出現(xiàn)異常的重要過(guò)程并被研究證實(shí)參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［9-10］。動(dòng)物研究［11］提示糖尿病大鼠周圍神經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響參與了大鼠周圍神經(jīng)系統(tǒng)的異常過(guò)程并提出糖尿病視網(wǎng)膜病變中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮了重要作用。文獻(xiàn)［12］提示對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡參與了視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示DR組血清PERK和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和DM組；DR組血清CHOP相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而與DM組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DM組血清PERK、CHOP和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。該結(jié)果說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜病變患者PERK、CHOP和IRE表達(dá)明顯升高。PERK屬于elF2a上游激酶家族一種I型跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期存在PERK信號(hào)通路的激活，該通路主要通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用、促進(jìn)細(xì)胞生存。研究［13］提示隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)及PERK特異性的磷酸酶去磷酸化抑制PERK，PERK通過(guò)誘導(dǎo)CHOP及IRE的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在調(diào)控的信號(hào)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及代謝異常等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究［14］提示LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)CHOP表達(dá)，這也與本研究結(jié)論一致。

進(jìn)一步對(duì)DR組不同分型患者組織凋亡蛋白結(jié)果顯示DR組PDR患者組織PERK和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于NPDR患者；DR組NPDR和PDR患者CHOP相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果說(shuō)明增殖期視網(wǎng)膜病變PERK和IRE相對(duì)表達(dá)量明顯高于NPDR患者并存在較強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)一步將DR患者組織PERK、CHOP和IRE表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：DR患者PERK和IRE呈正相關(guān)；CHOP與PERK、IRE無(wú)明顯相關(guān)性。該結(jié)果說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜病變患者PERK、CHOP和IRE的異常表達(dá)可能與視網(wǎng)膜病變的發(fā)展具有密切關(guān)系，可能與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切。

PERK通路及CHOP通路均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的兩條重要通路。PERK屬于蛋白激酶家族，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)應(yīng)激時(shí)C端位于細(xì)胞質(zhì)中，N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，C端由蘇氨酸蛋白激酶活性，但缺乏核酸內(nèi)切酶活性，而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，PERK解離形成寡聚體并因自身磷酸化激活具有特異性的絲氨酸，降低蛋白翻譯水平，進(jìn)而抑制胞內(nèi)蛋白合成［15］。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的另一轉(zhuǎn)錄因子，正常條件下CHOP主要機(jī)體含量極低，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)CHOP表達(dá)量聚集于細(xì)胞核內(nèi)，水平迅速升高進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程。此外，CHOP還具有調(diào)節(jié)Bcl-2基因等其他基因的轉(zhuǎn)錄，與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白形成二聚體促進(jìn)線粒體對(duì)促凋亡因子的敏感性，抑制Bcl-2表達(dá)。

綜上所述，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者PERK、CHOP和IRE表達(dá)明顯升高，可能在病變過(guò)程中有重要作用。