陳文軒 耿 麗 王丹丹 張目涵 張 哲 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，主要以反復(fù)發(fā)作的便血、腹痛和腹瀉等為臨床表現(xiàn)。目前IBD的發(fā)病機(jī)制并不完全明確，主要與環(huán)境因素、遺傳易感性、腸道微生物的穩(wěn)態(tài)失調(diào)以及自身免疫功能紊亂有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，急性期反應(yīng)蛋白在IBD中急劇增高，其中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)在中性粒細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，并通過其特殊的分子模式與不同的受體結(jié)合，在維持腸上皮細(xì)胞屏障和協(xié)調(diào)腸道菌群構(gòu)成中發(fā)揮重要的作用。此外，NGAL在IBD免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要的作用，具有作為IBD臨床生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。本文就NGAL在IBD中的研究進(jìn)展作一綜述。

一、NGAL的生物學(xué)特性

1. NGAL的基因定位：NGAL又稱脂質(zhì)運載蛋白-2、噬鐵蛋白、24p3[1]，是由178個氨基酸殘基構(gòu)成的小分子糖蛋白。通過對NGAL基因的測序和克隆發(fā)現(xiàn)，其編碼區(qū)位于9號染色體上，是由3 696個堿基對組成的LCN-2基因編碼區(qū)[2]，包括7個外顯子和6個內(nèi)含子以及一系列啟動子，如核因子-κB(NF-κB)和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件、維甲酸反應(yīng)元件、雌激素反應(yīng)元件等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和核受體反應(yīng)元件[3]。

2. NGAL的合成：NGAL于中性粒細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)，是中性粒細(xì)胞次級顆粒的重要組成部分。目前已證實NGAL存在于內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟、胃腸道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元和各種免疫細(xì)胞中，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞[4]。目前已證實多種細(xì)胞因子在IBD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5]。白細(xì)胞介素(IL)-17和IL-22可協(xié)同誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞內(nèi)NGAL基因轉(zhuǎn)錄[6]。此外，IL-1β、IL-6、IL-10以及Toll樣受體(TLR)配體可通過激活NF-κB/STAT3途徑，促進(jìn)NGAL的生成[7]。有研究表明，IBD患者中性粒細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中NGAL生成明顯增多[8]。

3.NGAL的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其受體：NGAL屬于載脂蛋白超家族，具有高度保守的三級桶狀結(jié)構(gòu)，提供了一個疏水腔來結(jié)合各種親脂配體，包括維甲酸、孕酮、前列腺素、脂肪酸、類固醇、白三烯B4和血小板激活因子[1]。有研究表明，NGAL在機(jī)體以單體、同型二聚體以及與明膠酶基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)共價結(jié)合形成大小為135 kDa(1 Da=0.992 1 u)的異二聚體三種形式存在[9]。NGAL有兩種不同的細(xì)胞表面受體，即溶質(zhì)載體家族22成員17(solute carrier family 22 member 17, SLC22A17)，又稱24p3R或NGALR2，以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2(low density lipoprotein receptor-related protein 2, LRP2)，又稱Megalin。高水平24p3R在特異性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肺和腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，Megalin是一種多配體內(nèi)吞噬受體，在某些類型的吸收性上皮細(xì)胞如甲狀腺細(xì)胞中高表達(dá)[10]。

二、NGAL在IBD中的研究進(jìn)展

IBD是一種腸黏膜異常免疫反應(yīng)、腸上皮細(xì)胞屏障減弱以及腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂等多種因素相互作用的胃腸道疾病。在小鼠和人類的結(jié)腸炎組織中，腸上皮細(xì)胞是產(chǎn)生NGAL的主要細(xì)胞，NGAL可獨立調(diào)節(jié)導(dǎo)致腸道功能紊亂的各個元素[11]，包括同時對擾亂腸道菌群的抑菌作用、對損傷腸道屏障的修復(fù)作用，在免疫調(diào)控方面也發(fā)揮促炎/抗炎等雙重作用。有研究[12]認(rèn)為NGAL可作為IBD的炎性標(biāo)志物。

1.NGAL促進(jìn)IBD患者腸道微生物穩(wěn)態(tài)平衡：人體腸道內(nèi)微生物數(shù)量約為1.0×1014個，種類超過1 000種，包括細(xì)菌、病毒、真菌等，與宿主形成了一個相互依賴又相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者的共生菌與潛在致病性微生物之間存在動態(tài)失衡，如致病性大腸埃希菌增多、有益菌乳桿菌減少[14]。鐵對多種細(xì)菌生長至關(guān)重要，NGAL通過螯合鐵載體結(jié)合的鐵，抑制多種細(xì)菌的生長[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞中NGAL通過與大腸埃希菌分泌的鐵結(jié)合蛋白Ent結(jié)合，形成NGAL-Ent-鐵復(fù)合物，抑制大腸埃希菌的增殖[16]；過表達(dá)NGAL和外源性重組NGAL均能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌的生長，NGAL缺乏會促進(jìn)受感染上皮內(nèi)分枝桿菌的增殖，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。乳桿菌等一些有益菌群可產(chǎn)生短鏈脂肪酸、色氨酸及其衍生物、膽汁酸等，在維持IBD腸黏膜屏障中發(fā)揮重要作用。乳桿菌的增殖并不需要鐵，而通過基因修飾產(chǎn)生分泌NGAL的乳桿菌，提高了其在極端pH值、高濃度膽汁酸、氧化環(huán)境等極端狀態(tài)下的存活力[17]，并明顯抑制大腸埃希菌的生長、降低腸桿菌素的活性?？傊琋GAL在維持腸道微生物群穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

2. NGAL維持腸上皮細(xì)胞屏障完整性：腸上皮細(xì)胞在維持腸道屏障功能和預(yù)防腸道炎癥中起有重要作用，IBD患者腸上皮細(xì)胞和相關(guān)黏膜屏障存在明顯損傷[18]。NGAL與含鐵的疏水小分子鐵載體結(jié)合，將鐵載體轉(zhuǎn)運至上皮細(xì)胞內(nèi)，激活胞質(zhì)鐵依賴途徑，促進(jìn)上皮細(xì)胞成熟。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)作為上皮細(xì)胞穩(wěn)定因子，可促進(jìn)多種傷口愈合相關(guān)蛋白如黏附蛋白等基因的上調(diào)[19]。NGAL通過促進(jìn)HIF-1α的生成，進(jìn)一步增強(qiáng)三葉因子3(trefoil factor 3, TFF3)在上皮細(xì)胞的表達(dá)，增強(qiáng)腸上皮屏障保護(hù)功能。此外，NGAL可促進(jìn)抗氧化酶(超氧化物歧化酶和血紅素加氧酶)的表達(dá)顯著上調(diào)，減少氧化應(yīng)激對上皮細(xì)胞的損傷。一項體外研究[11]發(fā)現(xiàn)，NGAL對H2O2導(dǎo)致的上皮細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，而給予重組NGAL可促進(jìn)損傷的單層結(jié)腸上皮細(xì)胞遷移，重建上皮細(xì)胞完整性。另有研究發(fā)現(xiàn)，NGAL可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移，在促進(jìn)腸道炎癥發(fā)生的同時，促進(jìn)上皮細(xì)胞雙向調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生，維持腸道屏障功能和增強(qiáng)組織修復(fù)功能[20]。由此可見，NGAL可保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷，在維持腸上皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。

3.NGAL在IBD腸道免疫中的抗炎/促炎機(jī)制：腸道免疫系統(tǒng)協(xié)調(diào)機(jī)制是一個復(fù)雜的生物過程，通過消滅入侵的微生物，保護(hù)宿主免受感染。NGAL主要通過其鐵螯合劑的功能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[21]。IBD患者胃腸道存在異常的黏膜免疫調(diào)節(jié)，NGAL通過招募炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞)和誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，NGAL可通過誘導(dǎo)趨化因子受體2(chemokine receptors 2,CXCR2)和肝巨噬細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)與單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)結(jié)合，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向炎癥部位的遷移[22]，加重腸道炎癥反應(yīng)。此外，在NGAL缺乏小鼠中，促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)、趨化因子(MIP-2和MCP-1)和抗炎因子(IL-10)等細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，下調(diào)多種細(xì)胞因子的mRNA水平[23]，間接說明NGAL在調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞因子中發(fā)揮重要作用。

目前多認(rèn)為NGAL參與腸道異常免疫反應(yīng)的發(fā)生，但有研究發(fā)現(xiàn)NGAL通過與細(xì)菌衍生的鐵載體Ent結(jié)合，可防止髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的失活，并進(jìn)一步增強(qiáng)腸道中性粒細(xì)胞的抗菌功能[24]，減輕腸道炎癥。自噬是一種機(jī)體對各種應(yīng)激的自我保護(hù)反應(yīng)，在緩解過度激活的炎癥和增強(qiáng)機(jī)體自我防御中發(fā)揮重要作用[25]，自噬相關(guān)基因ATG16L1和IRGM的編碼突變增加了IBD的患病率。有研究[26]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在NGAL/IL-10雙敲除的巨噬細(xì)胞中，自噬蛋白LC3-Ⅱ的形成明顯減少，而植入分泌NGAL的巨噬細(xì)胞后，可增加LC3-Ⅱ的生成，減輕腸道炎癥。由此可見，NGAL在調(diào)節(jié)機(jī)體促炎/抗炎方面發(fā)揮重要作用，但具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

三、NGAL與IBD臨床檢測

NGAL為診斷急性腎損傷的生化金標(biāo)準(zhǔn)[27]，其作為一種診斷性生物學(xué)標(biāo)志物引起了廣泛的關(guān)注。有研究指出，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、沙門菌誘導(dǎo)的腸胃炎，以及TLR5敲除的自發(fā)性結(jié)腸炎小鼠中，NGAL水平均明顯增加[1]。Chassaing等[28]的研究證實NGAL為小鼠模型結(jié)腸炎的敏感生物學(xué)標(biāo)志物。與健康對照組相比，編碼NGAL的基因LCN2是UC或CD患者結(jié)腸活檢中最常見的基因之一[29]。在IBD疾病活動期，NGAL在結(jié)腸組織、血清、尿液、糞便中均明顯升高，其濃度與臨床活動性和內(nèi)鏡下病變活動性具有明顯相關(guān)性[30]。此外，NGAL在不同的生物液體包括膽汁、支氣管肺泡灌洗液、胸水、腹水和腦脊液[31]中可檢測到。

目前臨床上常用于檢測IBD的生物學(xué)標(biāo)志物主要為鈣衛(wèi)蛋白和乳鐵蛋白。一項對鈣衛(wèi)蛋白和乳鐵蛋白評估IBD黏膜愈合敏感性和特異性的總結(jié)研究[32]發(fā)現(xiàn)，不同研究間糞鈣衛(wèi)蛋白和乳鐵蛋白與內(nèi)鏡下疾病活動性關(guān)系的結(jié)果不一致。而NGAL除在中性粒細(xì)胞中表達(dá)外，還可見于小鼠和人類炎癥性結(jié)腸組織中，腸上皮細(xì)胞是產(chǎn)生NGAL的主要場所。NGAL較鈣衛(wèi)蛋白更能反映當(dāng)中性粒細(xì)胞浸潤較少時腸道炎癥緩解的狀態(tài)[33]。且機(jī)體NGAL水平不受運動或飲食等干預(yù)類型以及BMI變化的影響，并隨著時間的推移不受運動或飲食調(diào)節(jié)的影響[34]，這也為其成為IBD生物學(xué)標(biāo)志物提供了條件。更有學(xué)者認(rèn)為NGAL可與已建立的生物學(xué)標(biāo)志物鈣衛(wèi)蛋白相媲美[8]。

四、展望

綜上所述，NGAL在維持腸上皮細(xì)胞屏障和調(diào)節(jié)腸道菌群的組成等方面發(fā)揮重要作用，為采用基因修飾技術(shù)提高益生菌在治療腸道炎癥方面提供新思路，其本身的特性也展現(xiàn)了作為IBD臨床生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。此外，NGAL相關(guān)受體在小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及甲狀腺細(xì)胞等中表達(dá)，可進(jìn)一步探索NGAL在IBD患者焦慮抑郁以及明顯消瘦中的作用。但由于NGAL具體作用機(jī)制存在諸多不同的觀點，仍需進(jìn)一步研究深化NGAL在基因分子水平上的認(rèn)識，促進(jìn)NGAL在IBD治療中的應(yīng)用。