陳 鑫 李國(guó)熊 方家恒 孫倚天 董 賽 楊文君

杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科1(310015) 病理科2

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種在腸道菌群的參與下，由環(huán)境等因素作用于遺傳易感者引起的腸道黏膜異常免疫反應(yīng)，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。隨著發(fā)展中國(guó)家的工業(yè)化進(jìn)程，其IBD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferases, FUTs)可催化蛋白質(zhì)完成巖藻糖基化，從而影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，參與受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要的生命進(jìn)程。其中，F(xiàn)UT2和FUT3可特異性催化人類組織血型抗原(histo-blood group antigens)形成，并與宿主與腸道微生物的相互作用以及IBD腸道黏膜炎癥之間存在密切聯(lián)系[2]。Coyne等[3]發(fā)現(xiàn)，擬桿菌可經(jīng)由與宿主腸上皮細(xì)胞類似的途徑對(duì)其表面莢膜多糖和糖蛋白進(jìn)行巖藻糖基化修飾，通過(guò)與宿主協(xié)調(diào)表達(dá)巖藻糖以保障自身定植；Goto等[4]發(fā)現(xiàn)由FUT2調(diào)控的腸上皮細(xì)胞巖藻糖基化對(duì)致病菌感染具有保護(hù)作用。然而，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究多為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，關(guān)于IBD患者炎癥黏膜FUT2和FUT3表達(dá)的臨床研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究收集IBD患者的臨床資料，結(jié)合結(jié)腸鏡活檢標(biāo)本FUT2、FUT3表達(dá)檢測(cè)，旨在探討不同臨床特征IBD患者的FUT2、FUT3表達(dá)變化，以期有助于IBD的臨床診斷和療效評(píng)價(jià)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

連續(xù)納入于2019年1月—2020年12月在杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院就診、初診為IBD活動(dòng)期的漢族人群。IBD診斷符合2012年版我國(guó)IBD診治共識(shí)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)法明確診斷；②其他腸道疾病，包括痢疾、腸結(jié)核、腸傷寒、耶爾森菌腸炎、彎曲桿菌結(jié)腸炎、嗜酸細(xì)胞性結(jié)腸炎、放射性腸炎、外傷、缺血性腸炎、結(jié)直腸黏膜脫垂綜合征、各種寄生蟲(chóng)感染、阿米巴結(jié)腸炎、藥物性腸病、腸型白塞病、單純性潰瘍、淀粉樣變性等；③入組前2個(gè)月內(nèi)使用抗菌藥物。結(jié)果共107例活動(dòng)期IBD患者納入研究，同期行健康體檢、結(jié)腸鏡檢查無(wú)異常發(fā)現(xiàn)的66例漢族個(gè)體作為對(duì)照組。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[2018(倫02)-KS-012]。

二、方法

1. 免疫組化染色檢測(cè)腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)：IBD組收集開(kāi)始藥物治療前的結(jié)腸鏡活檢標(biāo)本(取炎癥黏膜組織)，對(duì)照組收集正常結(jié)腸黏膜組織，4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，采用EnVision二步法行FUT2、FUT3免疫組化染色。兔FUT2、FUT3抗體為Biorbyt Ltd.產(chǎn)品，二步法免疫組化試劑盒(多聚HRP標(biāo)記抗兔/鼠IgG，DAB顯色液)為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡下觀察到褐黃色陽(yáng)性信號(hào)判定為相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性，未觀察到褐黃色信號(hào)判定為表達(dá)陰性。由2名具有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師讀片，協(xié)商得出結(jié)果。

使用用徠卡DMI4000B倒置顯微鏡對(duì)每張切片的FUT2、FUT3顯色結(jié)果進(jìn)行觀察、定位。于高倍視野(×200)下隨機(jī)選取3個(gè)彼此不重疊的視野采集圖像，將同一張切片的3幅圖像輸入Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，分別計(jì)算平均光密度(average optical density, AOD)，3幅圖像的AOD值均數(shù)作為該張切片的FUT2、FUT3相對(duì)表達(dá)量。

2. 臨床資料收集和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估：采集入組IBD患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、生活習(xí)慣、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要包括C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin, FC)和血紅蛋白(hemoglobin, Hb)。炎癥指標(biāo)結(jié)果異常判定標(biāo)準(zhǔn)：CRP10 mg/L；ESR26 mm/h；FC50 μg/g。

UC疾病嚴(yán)重程度的評(píng)估采用改良 Mayo評(píng)分，CD疾病嚴(yán)重程度的評(píng)估采用Best CD活動(dòng)指數(shù)(CD activity indext, CDAI)。病變范圍/部位分型采用蒙特利爾分型[5]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

107例IBD患者中，UC 70例，CD 37例。UC組男性48例，女性22例，年齡(49.6±15.6)歲(15～83歲)；CD組男性27例，女性10例，年齡(37.6±15.7)歲(15～72歲)。66例健康對(duì)照者中男性48例，女性18例，年齡(52.5±14.0)歲(18～87歲)。三組間性別構(gòu)成和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。

二、腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)

IBD患者和健康對(duì)照者腸黏膜FUT2、FUT3顯色情況見(jiàn)圖1。CD組FUT2陽(yáng)性率低于對(duì)照組，F(xiàn)UT3陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；UC組與對(duì)照組間FUT2、FUT3陽(yáng)性率無(wú)明顯差異(P均0.05；表1)。

A：非炎癥黏膜FUT2表達(dá)陽(yáng)性；B：非炎癥黏膜FUT2表達(dá)陰性 ；C：非炎癥黏膜FUT3表達(dá)陽(yáng)性；D：非炎癥黏膜FUT3表達(dá)陰性；E：IBD炎癥黏膜FUT2表達(dá)陽(yáng)性；F：IBD炎癥黏膜FUT2表達(dá)陰性；G：IBD炎癥黏膜FUT3表達(dá)陽(yáng)性；H：IBD炎癥黏膜FUT3表達(dá)陰性圖1 腸黏膜FUT2、FUT3顯色情況(免疫組化染色，×200)

表1 IBD組與對(duì)照組腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)陽(yáng)性率比較

進(jìn)一步根據(jù)AOD均值行半定量分析，UC組FUT2、FUT3相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，CD組FUT2相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，F(xiàn)UT3相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；表2)。

表2 IBD組與對(duì)照組腸黏膜FUT2、FUT3相對(duì)表達(dá)量比較

三、FUT2、FUT3表達(dá)與IBD患者臨床特征的關(guān)系

不同疾病嚴(yán)重程度、病變范圍/部位、臨床表現(xiàn)(腹痛、腹瀉、發(fā)熱、貧血)以及不同生活習(xí)慣(吸煙、飲酒)IBD患者的腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05；表3、表4)。進(jìn)一步行多元線性回歸分析，結(jié)果同樣表明FUT2、FUT3表達(dá)與IBD患者的臨床表現(xiàn)和生活習(xí)慣無(wú)明顯相關(guān)性(P均0.05；表5)。

表3 UC、CD組腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度和病變范圍/部位的關(guān)系

表4 UC、CD組腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)與臨床表現(xiàn)和生活習(xí)慣的關(guān)系

表5 腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)與IBD患者臨床表現(xiàn)和生活習(xí)慣的多因素分析(多元線性回歸分析)

四、FUT2、FUT3表達(dá)與炎癥指標(biāo)的關(guān)系

CRP、ESR、FC水平升高與正常IBD患者的腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)分布見(jiàn)圖2。3項(xiàng)炎癥指標(biāo)升高與正常組間FUT2表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)；CRP、FC升高與正常組間FUT3表達(dá)差異顯著(P均<0.05；表6)。進(jìn)一步行Pearson相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果同樣表明FUT2表達(dá)與各項(xiàng)炎癥指標(biāo)之間無(wú)明顯相關(guān)性(P均0.05)，F(xiàn)UT3表達(dá)與CRP、FC水平之間存在一定的正相關(guān)性(r=0.259,P=0.007;r=0.388,P=0.001)。

圖2 CRP、ESR、FC水平升高與正常IBD組間FUT2、 FUT3 AOD分布比較

表6 IBD患者腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)與炎癥指標(biāo)的關(guān)系

討 論

近20年來(lái)，中國(guó)IBD病例數(shù)呈增長(zhǎng)迅速，流行病學(xué)調(diào)查顯示，南方城市IBD標(biāo)化發(fā)病率為3.14/10萬(wàn)，北方城市為1.77/10萬(wàn)[6]。盡管臨床醫(yī)師對(duì)IBD的關(guān)注度已有明顯提升，但其精準(zhǔn)診斷和治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。ABH抗原和Lewis抗原統(tǒng)稱人類組織血型抗原，其合成受FUT2、FUT3特異性調(diào)節(jié)(圖3)。FUT2、FUT3在胃腸道黏膜組織和分泌液中高表達(dá)，不僅可作為腸道菌群的碳源和結(jié)合位點(diǎn)，還可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體激活等諸多重要生命進(jìn)程[2]。已有較多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)FUT2、FUT3與IBD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但相關(guān)臨床研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

圖3 人類組織血型抗原合成步驟

鑒于長(zhǎng)期應(yīng)用抗菌藥物會(huì)降低腸黏膜巖藻糖含量[7]，考慮到我國(guó)的抗菌藥物使用現(xiàn)狀，本研究設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定排除入組前2個(gè)月內(nèi)使用抗菌藥物的患者。EnVison二步法免疫組化染色顯示，健康對(duì)照者腸黏膜FUT2、FUT3陽(yáng)性率分別為78.8%、80.3%，UC和CD患者的相應(yīng)數(shù)據(jù)分別為81.4%、84.3%和59.5%、94.6%，CD組與對(duì)照組間存在顯著差異。進(jìn)一步行半定量AOD值分析，UC組FUT2、FUT3相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，CD組FUT2相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)UT3相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表達(dá)變化趨勢(shì)與陽(yáng)性率分析結(jié)果基本一致。單因素和多因素分析顯示，腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)與IBD患者的疾病嚴(yán)重程度(輕、中、重度)、病變范圍/部位(蒙特利爾分型)、臨床表現(xiàn)(腹痛、腹瀉、發(fā)熱、貧血)和煙酒嗜好均無(wú)明顯相關(guān)性；Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，F(xiàn)UT3表達(dá)與臨床常用炎癥指標(biāo)CRP和FC之間存在一定正相關(guān)性，CRP和FC升高者腸黏膜FUT3表達(dá)亦顯著升高；FUT2表達(dá)與CRP、ESR、FC之間均不存在相關(guān)性。

有研究顯示，20%的白種人因FUT2基因多態(tài)性而不表達(dá)ABO血型抗原[8]。關(guān)于FUT2基因多態(tài)性與IBD的關(guān)系，不同國(guó)家、不同種族人群的研究結(jié)果不完全一致。國(guó)內(nèi)有學(xué)者分析了FUT2基因多態(tài)性對(duì)新疆地區(qū)漢族和維吾爾族人群UC易感性的影響，發(fā)現(xiàn)rs281377位點(diǎn)多態(tài)性與漢族人群的UC易感性相關(guān)，rs1047781位點(diǎn)多態(tài)性與維吾爾族人群的UC易感性相關(guān)，而rs601338位點(diǎn)多態(tài)性與兩組人群的UC易感性均相關(guān)[9]。另一項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究[10]則顯示FUT2基因多態(tài)性與東南地區(qū)人群的CD易感性相關(guān)，與UC易感性無(wú)關(guān)。其他國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究也證實(shí)了FUT2基因多態(tài)性與漢族人群CD易感性之間的相關(guān)性[11]。McGovern等[8]對(duì)白種人的全基因組關(guān)聯(lián)研究同樣表明FUT2基因多態(tài)性與CD易感性相關(guān)。韓國(guó)學(xué)者的研究[12]顯示，F(xiàn)UT2非分泌型等位基因與CD顯著相關(guān)，分泌型FUT2是亞洲人群罹患CD的保護(hù)因素。本組研究對(duì)象均為漢族，CD組FUT2陽(yáng)性率僅為59.5%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組的78.8%，F(xiàn)UT2相對(duì)表達(dá)量亦顯著低于對(duì)照組，在蛋白水平證實(shí)了FUT2基因弱功能性或失功能性突變與CD易感性之間的聯(lián)系。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CD組FUT3陽(yáng)性率和相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究表明FUT3基因rs28362459、rs3745635位點(diǎn)突變與特定病變部位的CD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[11，13]。

盡管大量研究指出了FUT2、FUT3基因多態(tài)性與IBD易感性之間的聯(lián)系，但鮮有研究通過(guò)檢測(cè)兩者在腸黏膜中的表達(dá)變化分析其與IBD的關(guān)系。國(guó)內(nèi)有學(xué)者采用免疫組化方法檢測(cè)了7例浙江籍漢族UC患者乙狀結(jié)腸黏膜中與FUT2、FUT3相關(guān)的Lewis a、b抗原表達(dá)，發(fā)現(xiàn)炎癥和非炎癥黏膜隱窩上皮的Lewis a抗原表達(dá)均顯著高于作為對(duì)照組的結(jié)腸息肉患者，其原因可能為FUT2基因突變使其編碼蛋白失去正常催化功能，血型前體物質(zhì)不能被催化生成H抗原，而只能經(jīng)由FUT3酶催化生成Lewis a抗原，導(dǎo)致Lewis a抗原過(guò)表達(dá)，通過(guò)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)UC發(fā)病起促進(jìn)作用[14-15]。本組UC患者FUT2相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，CD患者FUT2相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，提示檢測(cè)腸黏膜FUT2表達(dá)或可為IBD的診斷以及UC與CD的鑒別提供幫助，但仍需增加樣本量進(jìn)一步明確。

研究顯示炎癥反應(yīng)可影響多種糖蛋白的糖基化水平。Delmotte等[16]發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可上調(diào)人支氣管黏膜中的FUT3基因表達(dá)及其酶活性，與嚴(yán)重肺部感染患者氣道黏液中的唾液酸化Lewis x抗原表位表達(dá)增加相一致。Magalh?es等[17]的研究也顯示幽門(mén)螺桿菌感染和胃黏膜炎癥可上調(diào)FUT3基因并增加唾液酸化Lewis a/x抗原表達(dá)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)UC和CD患者腸道炎癥黏膜FUT3表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照者。

在IBD患者的腸黏膜中可觀察到糖基化水平降低，提示黏液層缺陷可能導(dǎo)致細(xì)菌與上皮接觸的機(jī)會(huì)增加，從而觸發(fā)腸道炎癥反應(yīng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，能維持腸道穩(wěn)態(tài)、對(duì)結(jié)腸炎發(fā)揮保護(hù)作用的活化轉(zhuǎn)錄因子3(ATF3)缺失可使腸上皮巖藻糖基化水平和FUT2表達(dá)下調(diào)[19]；而給予外源性游離巖藻糖可顯著減輕模型小鼠的結(jié)腸炎癥，緩解其腹瀉、血便、體質(zhì)量減輕等結(jié)腸炎癥狀[20-21]。Brazil等[22]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT3系通過(guò)催化Lewis a抗原的生物學(xué)合成介導(dǎo)多形核白細(xì)胞經(jīng)腸上皮進(jìn)入腸腔，從而促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)。本研究也關(guān)注了FUT2、FUT3表達(dá)與臨床常用IBD炎癥指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CRP、FC水平升高的IBD患者FUT3表達(dá)顯著高于相應(yīng)指標(biāo)正常者，相關(guān)性分析顯示FUT3表達(dá)與CRP、FC之間存在一定的正相關(guān)性，表明該指標(biāo)或可用于IBD的療效評(píng)估。

綜上所述，腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)或可成為IBD的輔助診斷和療效評(píng)估指標(biāo)。本研究中FUT2、FUT3表達(dá)與IBD患者的疾病嚴(yán)重程度、病變范圍/部位、臨床表現(xiàn)、煙酒嗜好均無(wú)相關(guān)性，可能與樣本量有限有關(guān)。后續(xù)擬繼續(xù)增加樣本量，并對(duì)兩者表達(dá)情況進(jìn)行治療前后對(duì)比，以期更精準(zhǔn)地探索IBD患者腸黏膜FUT2、FUT3表達(dá)的臨床意義。