趙洺良 王明剛 劉振玉 孫桂玉 王清亭 杜昌余 陳陽(yáng)生

正大制藥(青島)有限公司，山東 青島 266510

人類皮膚中的UV-B(290～315 nm)依賴性非酶反應(yīng)將膽固醇前體7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素原D3，維生素原D3進(jìn)一步異構(gòu)化為維生素D3(圖1 A)[1]。 同樣，經(jīng)紫外線B輻射的植物和蘑菇也能夠使膜固醇麥角固醇生成異構(gòu)化的維生素D2(圖1B)[2]。兩種類固醇本身都是生物惰性的，須使其C-25處被活化，然后羥基化生成25(OH)D3(圖1C)和25(OH)D2，最后在C-1處羥基化，分別生成1,25(OH)2D3(圖1D)[3]和1, 25(OH)2D2。見(jiàn)圖1。

圖1 維生素D代謝產(chǎn)物和部分已上市維生素D類似物

25(OH)D3是最穩(wěn)定和最豐富的維生素D代謝產(chǎn)物，其血清水平是測(cè)定個(gè)體維生素D水平的生物標(biāo)志物[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，維生素D3的生物活性形式1,25(OH)2D3通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子維生素D受體(VDR)作為直接影響基因調(diào)控的核激素而起作用。維生素D的生理作用首先是調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)以維持骨骼鈣化[6]，同時(shí)還可以通過(guò)調(diào)控先天和適應(yīng)性免疫來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)微生物感染的應(yīng)激反應(yīng)水平[7]，比如在人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答中，維生素D起到至關(guān)重要的作用[8]。最后，維生素D還可以預(yù)防自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化等[9]。

隨著社會(huì)生活水平的不斷提高，現(xiàn)代人類的生活方式改變(例如主要呆在室內(nèi)，并在戶外被紡織品衣物覆蓋，以及使用各類防曬用品)，再加上季節(jié)和氣候的變化，導(dǎo)致了人體對(duì)紫外線中的UV-B暴露不足，維生素D3的內(nèi)源性生產(chǎn)水平有所降低。目前，人類食譜中僅富含脂肪的魚(yú)類和經(jīng)過(guò)UV-B照射的蘑菇具有較高含量的維生素D3或維生素D2，這導(dǎo)致了日常飲食中維生素D的攝入量普遍較低。因此，在某些國(guó)家/地區(qū)使用添加了維生素D3或維生素D2的牛奶、人造黃油和果汁作為維生素D補(bǔ)充劑。此外，有文獻(xiàn)[10]建議在冬季，尤其是中老年人和兒童，每天至少補(bǔ)充25 μg(1 000 IU)的維生素D3，以防止維生素D缺乏癥。維生素D缺乏不僅會(huì)導(dǎo)致某些兒童疾病(如佝僂病)，而且還會(huì)導(dǎo)致成年人罹患骨質(zhì)疏松癥或骨軟化癥[11],從而增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。此外，維生素D缺乏還會(huì)損害免疫系統(tǒng)的功能。近年來(lái)，普通人群對(duì)于維生素D補(bǔ)充劑的需求量明顯增加，維生素D補(bǔ)充產(chǎn)品的銷售額在10年內(nèi)增長(zhǎng)了近15倍[12]。

毫無(wú)疑問(wèn)，補(bǔ)充足夠的維生素D對(duì)于骨骼健康很重要[13]，但是過(guò)量服用維生素D3、1,25(OH)2D3或其合成類似物可能會(huì)導(dǎo)致組織鈣化[14]，并產(chǎn)生高血鈣癥。因此，目前開(kāi)發(fā)維生素D類似物的主要目的是通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，降低化合物的鈣化作用，提高選擇性。近幾十年來(lái)，各大制藥公司和科研團(tuán)隊(duì)總共開(kāi)發(fā)了3 000多種合成維生素D類似物，以提高原天然化合物的生物學(xué)特性，并期望用于治療皮膚自身免疫性疾病[15]或骨代謝疾病[16]。然而，到目前為止，只有少數(shù)維生素D類化合物進(jìn)入市場(chǎng)(圖1)。除了維生素D3被廣泛用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑之外，商業(yè)上比較成功的維生素D類似物有卡泊三醇(圖1E)、度骨化醇(圖1F)、阿法骨化醇(圖1G)、他骨化醇(圖1H)、帕立骨化醇(圖1I)、奧沙鈣醇(圖1 J)、氟骨化醇(圖1 K)和艾地骨化醇(圖1 L)[17-18]。維生素D3類似物如依奈骨化醇(圖1 M)或西奧骨化醇(圖1 N)，雖然在體外表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是在急性髓樣白血病或胰腺癌的II期臨床試驗(yàn)中均宣告失敗[19]。科研人員在研究[20-21]中發(fā)現(xiàn)，一些維生素D靶基因與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，例如抗菌肽(cathelicidin,CAMP)和編碼Toll樣受體4核心受體(CD14)，對(duì)該類化合物具有較強(qiáng)的應(yīng)答。該類藥物或化合物在抗癌試驗(yàn)中失敗，但在骨代謝疾病治療中成功，以及在免疫細(xì)胞中存在顯著的基因調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果表明，作為VDR配體的維生素D類化合物及其衍生物在骨代謝相關(guān)功能調(diào)節(jié)以及免疫疾病中比在癌癥中更加具有治療潛力，這也為該類藥物的臨床應(yīng)用指明了方向。

1 維生素D藥物作用機(jī)理

人類基因組中,維生素D受體(VDR)是唯一被表達(dá)的且能夠在亞納摩爾濃度下結(jié)合1,25(OH)2D3及其類似物的蛋白質(zhì)[22]，因此，維生素D類化合物的所有生理功能都是由VDR及其靶基因介導(dǎo)的[23]。VDR基因不僅在腸、腎和骨骼中表達(dá)水平較高，同時(shí)在其他多種人類組織和細(xì)胞類型中，也發(fā)現(xiàn)了VDR的表達(dá)[24]。這意味著與鈣穩(wěn)態(tài)和骨骼形成有關(guān)的組織細(xì)胞與具有免疫功能的細(xì)胞對(duì)環(huán)境維生素D的水平都有應(yīng)答作用[25]，從分子水平證實(shí)了維生素D類藥物對(duì)骨代謝以及免疫疾病具有治療作用。

進(jìn)一步的研究[26]發(fā)現(xiàn)，VDR配體誘導(dǎo)了LBD的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，LBD共抑制蛋白被共激活蛋白替代，這說(shuō)明，VDR配體結(jié)合誘導(dǎo)了受體不同的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用模式。VDR激動(dòng)劑可有效抑制LBD上的共阻遏物，并允許共激活因子與介體復(fù)合物特異性結(jié)合(圖2)。共激活因子還吸引染色質(zhì)修飾酶，這些酶在組蛋白VDR結(jié)合位點(diǎn)附近參與核小體組蛋白的讀取以及轉(zhuǎn)錄[27]。此外，染色質(zhì)重塑復(fù)合物的表觀遺傳學(xué)變化允許VDR結(jié)合增強(qiáng)子向整個(gè)人類基因組中數(shù)百至數(shù)千個(gè)基因上可及的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSSs)循環(huán)[28- 29]。這些增強(qiáng)子TSSs組裝體由配體激活的VDR觸發(fā)，最終可導(dǎo)致數(shù)百種主要的維生素D靶基因的表達(dá)增加或減少(圖2)。目前為止，有文獻(xiàn)[30]報(bào)道了約150種包括人、大鼠和斑馬魚(yú)VDR-LBD結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)晶。由于每種維生素D類似物的三個(gè)羥基基團(tuán)占據(jù)幾乎相同的位置，因此通過(guò)將LBD穩(wěn)定在大致相同的構(gòu)象中，維生素D類藥物的空間表現(xiàn)均類似于1,25(OH)2D3。

圖2 維生素D信號(hào)通路[26]

對(duì)維生素D類似物進(jìn)行化學(xué)修飾的主要目的是將三個(gè)錨定的羥基與1,25(OH)2D3保持在相同的位置，可以最有效地填充LBP，以保證足夠的氫鍵或疏水性接觸。此外，從頭設(shè)計(jì)的帶有修飾的非甾族化合物，例如通過(guò)具有芳香性的環(huán)交換經(jīng)典的甾族環(huán)結(jié)構(gòu)也被合成出來(lái)。研究這些分子的目的，是為了保留LBP內(nèi)表面襯里的氨基酸殘基的疏水相互作用，以及增加與芳族氨基酸殘基的堆積相互作用。本文同樣探討了這些不同種類的維生素D類似物的研究進(jìn)展。

2 側(cè)鏈修飾

Mourino等[31]報(bào)道了一系列具有剛性側(cè)鏈的維生素D類似物(圖3 A-3D)，該類化合物是以Inhoffen-Lythgoe二醇為原料，通過(guò)Wittig-Horner反應(yīng)聚合而成的。生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與1,25(OH)2D3相比，這些類似物使得VDR依賴性轉(zhuǎn)錄被顯著激活。最新的研究結(jié)果[32]表明, C-22位獨(dú)特的二炔類似物結(jié)構(gòu)修飾以及通過(guò)乙烯基(pinacolo)硼酸酯方法獲得的C-17位甲基取代類似物，前者在激活VDR方面的效力較低,后者比1,25(OH)2D3更有效地結(jié)合VDR。

1,25cD3(圖3E)是一種新穎的維生素D類似物，其中鄰-碳硼烷部分取代了C-25羥基[33]。盡管不含C-25羥基，但是1,25cD3對(duì)VDR的親和力是1,25(OH)2D3的2倍，并且在誘導(dǎo)靶基因活性方面與天然激素維生素D3具有同等活性，同時(shí)未顯示出不良的降鈣作用。此外，與大多數(shù)其他維生素D類似物一樣，1,2,5cD3與VDR的LBD的復(fù)合物的構(gòu)象與1,25(OH)2D3的構(gòu)象高度相似，蛋白質(zhì)三維模型也顯示出相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。對(duì)該蛋白結(jié)合域分析結(jié)果表明，螺旋H6和H7之間的環(huán)是受體激活的關(guān)鍵區(qū)域，螺旋H11的最后一部分顯示了0.6的偏移；碳硼烷側(cè)鏈比1,25(OH)2D3長(zhǎng)2.4?，但是它是疏水的，因此在VDR-LBP的這一部分中有利于與疏水氨基酸的相互作用。這一定程度上補(bǔ)償了C-25羥基基團(tuán)缺失造成的氫鍵損失(圖4 A, 圖4B)。這些影響在整體上使得1,25cD3化合物的VDR-LBD具有更高穩(wěn)定性。這一報(bào)道也使得C-25羥基在結(jié)構(gòu)中的重要性有所降低。

圖3 側(cè)鏈與A環(huán)分別修飾維生素D類似物

圖4 維生素D類似物與VDR的結(jié)合[33]

3 側(cè)鏈以及A環(huán)的共修飾

Yamamoto等[34]成功合成了一系列含有或不含有C-22S烷基取代基的維生素D類似物及C-22S烷基衍生物，并進(jìn)行了生物活性研究(圖5)。與僅進(jìn)行側(cè)鏈修飾的維生素D類似物相比，該類衍生物的VDR結(jié)合親和力相對(duì)25(OH)2D3降低了10倍。構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果[35]表明，化合物中C-22取代基體積的增加導(dǎo)致VDR結(jié)合親和力降低。具有正常側(cè)鏈的化合物在對(duì)靶基因檢測(cè)中顯示出很強(qiáng)的活性，而沒(méi)有C-22取代的化合物 (圖5 Aa, Ba, Ca, Da)甚至具有完全的激動(dòng)劑活性。相反，C-22S丁基取代的分子(圖5 Ac, Bc, Cc, Dc)由于體積增加，幾乎沒(méi)有激活能力，而C-22S乙基取代的化合物 (圖5 Ab, Bb, Cb, Db)則具有中等活性。此外，類似物Aa, Ba, Ca,和Da以濃度依賴的方式誘導(dǎo)VDR伴侶受體、黃醇X受體(RXR，圖2)和共激活肽的富集，而C-22S取代的化合物僅引起中等效應(yīng)[36]。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了側(cè)鏈的長(zhǎng)度與體積對(duì)維生素D類化合物的VDR活性具有至關(guān)重要的影響。

與其他C-22S 1,25(OH)2D3衍生物(圖5 E-H)[37]絡(luò)合的VDR-LBD晶體結(jié)構(gòu)初步證實(shí)了這些化合物通過(guò)將氨基酸L305旋轉(zhuǎn)約305°C，觸發(fā)LBP的額外腔向外延申約27°，以遮蓋側(cè)鏈丁基(圖4C)。當(dāng)配體不與受體的C末端螺旋H12相互作用時(shí)，這些化合物(配體)充當(dāng)VDR拮抗劑。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，由于共激活肽的存在，螺旋H12的位置始終保持在激動(dòng)位置，但是多個(gè)殘基從22-丁基旁由于擠壓移開(kāi)或旋轉(zhuǎn)。這些變化會(huì)削弱與H301(螺旋H6 / 7)、H393(H11)或F418(H12)的相互作用，并使LBD的該結(jié)構(gòu)區(qū)域不穩(wěn)定(圖4C)。研究[38]還發(fā)現(xiàn)，存在共激活肽的情況下，某些拮抗的22-丁基類似物具有激動(dòng)性構(gòu)象。這些結(jié)晶的人工蛋白復(fù)合物還可能具有一定的生理意義，例如在細(xì)胞環(huán)境中感測(cè)輔因子平衡情況，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的前景。

為了評(píng)估C-22上的甲基對(duì)化合物生物活性的影響，近年來(lái)，DeLuca等[39]采用Wittig-Horner反應(yīng)制備了化合物E的多種新衍生物(圖5)。與原化合物E相比，(20R)-25-羥基化側(cè)鏈(J)的單甲基化不會(huì)改變VDR結(jié)合親和力。但是在(20S)-25-羥基化的基礎(chǔ)上增加了22-甲基側(cè)鏈(K)使得化合物產(chǎn)生了更強(qiáng)的活性，VDR親和力增強(qiáng)[40]。 22R化合物Ka的VDR結(jié)合親和力是維生素D3的2.5倍，效力是22-epimer的250倍[41]。在“天然”側(cè)鏈(20R)(Ia)中具有22S-甲基類似物的生物活性比化合物(Ib)高10倍，而在“非天然”情況下(20S)，化合物Ja比化合物E的效力高4倍。當(dāng)在C-22處引入兩個(gè)甲基時(shí)，例如20R-化合物(Ka)和20S化合物(Kb)，其VDR結(jié)合親和力與1,25(OH)2D3相比得到增加，但是增幅不大[42]。這說(shuō)明C-22上的甲基的立體構(gòu)型對(duì)化合物的親和力有顯著影響，這與其在LBD中的相對(duì)位置有很大關(guān)系。

圖5 維生素D類似物

4 非甾體VDR配體

通過(guò)雙分子親核取代[43]可以合成包含疏水性單元的非甾體VDR激動(dòng)劑[44](圖5)。利用碳硼烷的疏水性，碳硼烷籠取代了天然維生素D的CD環(huán)。盡管其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單靈活，但與1,25(OH)2D3相比，基于碳硼烷的VDR配體對(duì)VDR只表現(xiàn)出中等的結(jié)合親和力。這些類似物是柔性的無(wú)環(huán)三元醇，缺乏A環(huán)和共軛三烯結(jié)構(gòu)，它們的結(jié)構(gòu)在碳硼烷碳上共享一條支鏈側(cè)鏈，而在另一碳上，分別與L、M或N三種不同的鏈結(jié)合。二醇的柔韌性有利于提高與VDR結(jié)合的親和力，但仍然比1,25(OH)2D3低100多倍。不過(guò)，這些化合物在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化方面具有較強(qiáng)活性[45-46]。

5 總結(jié)

綜上所述，化學(xué)合成方法和手段的豐富大大增加了藥物化學(xué)家們合成維生素D類似物的數(shù)量和種類。目前對(duì)于不含25-羥基的功能分子，例如鄰-碳烷化合物的合成和活性研究工作仍在繼續(xù)。 此外，現(xiàn)在有一些完全缺乏A環(huán)或CD環(huán)的分子，例如非甾體類維生素D類似物，仍可以與VDR相互作用，但目前報(bào)道較少。這些非甾體類維生素D類似物，有些在體外具有高活性，并且在體內(nèi)具有降低血鈣的作用。因此，預(yù)計(jì)未來(lái)非甾體維生素D類似物的報(bào)道將進(jìn)一步增加。

對(duì)VDR配體，即維生素D類似物的生物學(xué)特征的評(píng)估，仍然主要為體外活性實(shí)驗(yàn)，例如VDR親和力實(shí)驗(yàn)、靶基因結(jié)合測(cè)定以及不同癌細(xì)胞系中抗增殖和分化程度的測(cè)定。測(cè)定方法的多樣性使得活性數(shù)據(jù)難以一致，缺乏具體的量化標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法直接比較不同類型的維生素D類似物。而且，如果不改變檢測(cè)方法(例如分離新鮮的人外周血單核細(xì)胞中的基因表達(dá)譜)，就不可能準(zhǔn)確的推斷化合物的體內(nèi)活性情況[47]。這對(duì)該類化合物的進(jìn)一步優(yōu)化和應(yīng)用產(chǎn)生了不利影響。

近年來(lái)，關(guān)于維生素D類似物的研究幾乎僅在少數(shù)科研機(jī)構(gòu)中進(jìn)行，許多引人關(guān)注的VDR配體結(jié)構(gòu)優(yōu)化方法并未最大限度地被挖掘出來(lái)。隨著近150個(gè)VDR-LBD晶體結(jié)構(gòu)的解析，以及越來(lái)越多蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析的出現(xiàn)，顯示出科研人員對(duì)了解VDR激動(dòng)劑和拮抗劑的分子相互作用有著非常積極的興趣，有進(jìn)一步深入研究的可能。

然而，令人遺憾的是，針對(duì)癌癥的臨床試驗(yàn)失敗仍然極大地削弱了制藥企業(yè)對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)維生素D化合物的興趣。由于天然激素1,25(OH)2D3主要預(yù)防與骨骼和免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病，因此該分子及其合成衍生物可能不是治療癌癥的理想藥物。然而已有文獻(xiàn)[48-49]報(bào)道顯示人胰腺腫瘤基質(zhì)中卡泊三醇活化的VDR可以顯著減少胰腺炎和人腫瘤基質(zhì)中炎癥和纖維化的標(biāo)志物表達(dá)水平。這表明維生素D化合物可能對(duì)腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞造成一定影響，而不是直接抑制腫瘤微環(huán)境下的癌細(xì)胞的增殖，這說(shuō)明該類藥物的抗腫瘤作用機(jī)理還需進(jìn)一步發(fā)掘。實(shí)際上，迄今為止，有關(guān)VDR及其配體作用的全基因組數(shù)據(jù)大部分可從造血系統(tǒng)的細(xì)胞中獲得[50]。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了維生素D和VDR對(duì)骨代謝以及先天性和適應(yīng)性免疫的影響，并建議這些領(lǐng)域應(yīng)進(jìn)一步展開(kāi)探索以用于商業(yè)應(yīng)用。