馮宜蒀 來(lái)積芳 董萬(wàn)濤* 海云翔 王凱 張小云 滕彥橋

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減低，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，骨的脆性增加而易發(fā)生骨折為特點(diǎn)的常見(jiàn)全身性骨骼疾病[1]，中醫(yī)學(xué)屬“骨痿”“骨枯”范疇，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為“腎虛精虧”是OP發(fā)生的主要病機(jī)。腎主骨生髓，腎虛則精血無(wú)以化生，精虧髓乏則骨骼脆性增加，痿弱難用，故而引發(fā)OP。因此，從腎論治是中醫(yī)治療OP的基本大法[2]。

淫羊藿、熟地黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎二經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[3]。熟地黃味甘、性溫，功長(zhǎng)于補(bǔ)，具有益精填髓、補(bǔ)血養(yǎng)陰之效[4]。兩藥相須為用是補(bǔ)腎陽(yáng)、滋腎陰、填精髓的常用藥對(duì)，可見(jiàn)于經(jīng)典名方贊育丹及仙靈骨葆膠囊、骨疏康顆粒等中成藥中。研究發(fā)現(xiàn)，熟地、淫羊藿配伍可顯著提高糖尿病大鼠下肢骨密度，增加骨中鈣、磷含量[5]。“淫羊藿-熟地”藥對(duì)成分復(fù)雜，其對(duì)OP發(fā)揮的治療作用涉及機(jī)體調(diào)控的多個(gè)生物過(guò)程和信號(hào)通路。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)建立“藥對(duì)活性成分-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)，從多成分、多靶點(diǎn)角度闡釋“淫羊藿-熟地”治療OP的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)收集“淫羊藿-熟地”藥對(duì)化學(xué)成分；GeneCards(https:// www.Genecards.org/)、OMIM(htt ps://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)收集OP相關(guān)基因，Venny 2.1.0(https://bioinfo gp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具繪制韋恩圖，找出相關(guān)映射；STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析；clusterPr ofiler R包對(duì)所獲得的共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析；Cytoscape3.7.2(https://cytoscape.org/)軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)及數(shù)據(jù)分析。

1.2 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)主要活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)具有中藥小分子研究相關(guān)靶蛋白及相關(guān)功能的特點(diǎn)，是一種采用邏輯回歸、“棄一法交叉驗(yàn)證”構(gòu)建的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具[6]。通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)搜集“淫羊藿-熟地黃”所有化學(xué)成分，以Score cutoff≥20，P≤0.05作為篩選閾值并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道確定最終藥物活性成分。后對(duì)有效活性成分所對(duì)應(yīng)的潛在靶蛋白進(jìn)行逐一搜集，得到藥物對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。

1.3 OP疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)是信息較為全面的疾病靶點(diǎn)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)可提供基因、基因與疾病關(guān)系等多種信息，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)含有已知的孟德?tīng)柤膊　?5 000條基因信息和人類(lèi)關(guān)注的表型和基因型之間的關(guān)系[7]。以“osteoporosis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到OP疾病相關(guān)基因，對(duì)搜集到的疾病靶點(diǎn)處理、去重后，得到OP相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的潛在靶點(diǎn)

利用Venny2.1.0在線工具將“藥物-靶點(diǎn)”與“疾病-靶點(diǎn)”進(jìn)行映射，繪制Venny圖并得到“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的作用靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)蛋白與蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)具有顯示蛋白質(zhì)分子間直接物理相互作用和間接功能相關(guān)性的特點(diǎn)[8]。將1.4中獲取的藥物治療疾病潛在靶點(diǎn)上傳至在線STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白互作信息，并使用R軟件繪制互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目圖進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 生物功能與通路富集分析

使用clusterProfiler R包對(duì)獲取的“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)(pvalueCutoff<0.05，qvalueCutoff<0.05)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，探討“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的相關(guān)生物過(guò)程及信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)主要活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)輸入復(fù)方中藥進(jìn)行化合物及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)(Score cutoff≥20，P≤0.05)，共獲得“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)中地黃苷A(Rehmannioside)、尿嘧啶核苷(Uridine)、山柰酚(Kaempferol)、木蘭花堿(Magnoflorine)等13個(gè)主要化學(xué)成分和134個(gè)蛋白靶點(diǎn)。

2.2 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的潛在靶點(diǎn)

使用Venny2.1.0在線工具將獲取的134個(gè)復(fù)方(YYHSD)靶點(diǎn)和3 231個(gè)OP(經(jīng)OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共同篩選所得)靶點(diǎn)映射后得到共同靶基因57個(gè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)維恩圖

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用String軟件對(duì)上述57個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用R軟件繪制互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目圖，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多表示該基因處在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心位置，對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)起關(guān)鍵作用(圖2)。由圖3柱狀圖可以看出，前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、雄激素受體(AR)、雌激素受體1(ESR1)、細(xì)胞色素P450c17a(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)等可能是“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的核心靶點(diǎn)。

圖2 互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的GO富集分析

使用clusterProfiler R包對(duì)2.2中所獲取的57個(gè)“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。從生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3個(gè)層面對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行不同生物學(xué)過(guò)程分析，依據(jù)P<0.05列出排名靠前的GO富集分析結(jié)果，包含單胺類(lèi)運(yùn)輸(monoamine transport)、血液循環(huán)(blood circulation)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑(G protein-coupled receptor signaling pathway)等生物過(guò)程；軸突部分(axon part)、神經(jīng)元細(xì)胞體(neuronal cell body)、軸突終末(axon terminus)等細(xì)胞成分；黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合(flavin adenine dinucleotide binding)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等分子功能。見(jiàn)圖4、5。

圖4 GO富集結(jié)果柱狀圖

圖5 GO富集結(jié)果氣泡圖

2.5 “淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的KEGG通路分析

使用clusterProfiler R包對(duì)2.2中所獲取的57個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，確定了11條主要信號(hào)通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、類(lèi)固醇激素的合成(steroid hormone biosynthesis)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)等，涉及代謝、炎癥、免疫、激素合成等多個(gè)方面，見(jiàn)表1、圖6。

表1 KEGG通路分析

圖6 KEGG富集結(jié)果柱狀圖

2.6 構(gòu)建“藥物-活性成分-OP-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將OP和“淫羊藿-熟地黃”復(fù)方(YYHSD)獲得的57個(gè)靶點(diǎn)，整理出“藥物-活性成分-OP-作用靶點(diǎn)”交集網(wǎng)絡(luò)，獲得135對(duì)關(guān)系對(duì)數(shù)據(jù)，72個(gè)節(jié)點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行圖形可視化(圖7)。紅色六邊形代表骨質(zhì)疏松癥，藍(lán)色四邊形代表中藥，黃色三角形代表化合物，綠色圓形代表靶點(diǎn)。

圖7 YYHSD-骨質(zhì)疏松癥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

單味中藥及復(fù)方治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥具有整體調(diào)節(jié)、副作用小、療效確切等優(yōu)勢(shì)[9]，通過(guò)作用于不同的器官或組織，可在多層面、多途徑、多靶點(diǎn)上發(fā)揮補(bǔ)腎益精強(qiáng)骨之功。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從藥物、疾病兩方面分析了“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)有效成分，篩選出“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的潛在靶點(diǎn)，并對(duì)其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了功能富集和信號(hào)通路富集分析。

結(jié)果表明，地黃苷A、梓醇、山柰酚等是“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)中抗OP的主要成分。熟地黃主要活性成分環(huán)烯醚萜苷主含地黃苷A及梓醇等成分[10]，地黃苷A能夠增加骨髓有核細(xì)胞數(shù)和DNA含量，促進(jìn)粒細(xì)胞增殖，亦可通過(guò)刺激B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能[11-12]。由此推斷，地黃苷A對(duì)OP發(fā)揮治療作用可能與其促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖及增強(qiáng)免疫有關(guān)。OP引起骨髓微環(huán)境病理改變，影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖與遷移，促進(jìn)其凋亡，這使得OP時(shí)正常MSCs難以分化為成骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)受損骨組織[13]。骨系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)間存在密切聯(lián)系，OP的發(fā)生使T細(xì)胞被激活，活化的T細(xì)胞分泌 TNF-α、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)，進(jìn)一步刺激核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達(dá)，從而激活破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松加重[14]。梓醇可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及骨形成調(diào)節(jié)骨代謝[15-16]，亦可上調(diào)BMP2、RUNX2和Osteriex等調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞形成、分化關(guān)鍵因子的表達(dá)，增加MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖，提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性(ALP)及增加骨橋蛋白，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[17]。山奈酚可顯著增加早期和晚期成骨參數(shù)，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、膠原合成、Runx2、osterix、骨橋蛋白和骨唾液蛋白mRNA表達(dá)水平。通過(guò)刺激雌激素信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而激活WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，實(shí)現(xiàn)其潛在的護(hù)骨作用[18]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及撲分析后發(fā)現(xiàn)PTGS2、AR、ESR1、CYP19A1等可能是藥物發(fā)揮治療作用的核心靶點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS)又稱(chēng)環(huán)氧合酶(COX)，COX-1和COX-2是其兩個(gè)亞型。研究證實(shí)，在誘導(dǎo)骨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，COX-2表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)可降低顱骨細(xì)胞培養(yǎng)基中成骨細(xì)胞的分化，通過(guò)破壞COX-2的基因可促進(jìn)大鼠顱骨細(xì)胞中成骨細(xì)胞的增殖[19]。另有研究表明，去勢(shì)大鼠的骨組織中COX-2表達(dá)增強(qiáng)，通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)，可減低破骨細(xì)胞的分化[20-21]。雄激素調(diào)節(jié)骨代謝依賴(lài)AR介導(dǎo)，AR在MSCs、成骨、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中均有明顯表達(dá)，其主要通過(guò)促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞骨化、礦化以及抑制破骨細(xì)胞分化等方式進(jìn)行，調(diào)控機(jī)制與Wnt/β-catenin、MAPK、BMP/SmadsRunx2等通路有關(guān)[22]。ESR是一類(lèi)配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，包括ESR1和ESR2。ESR1與中國(guó)絕經(jīng)后婦女的骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性[23]，ESR1調(diào)節(jié)骨代謝可能通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)途徑和抑制IL-6的活動(dòng)來(lái)發(fā)揮雌激素激動(dòng)劑樣作用[24-25]。芳香化酶抑制劑(AIs)可通過(guò)抑制外周組織CYP19A1活性以降低循環(huán)血中的雌激素水平，導(dǎo)致人體骨密度減低，骨量丟失嚴(yán)重[26]。這提示CYP19A1可能是“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，為“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的分子作用基礎(chǔ)給出了新的預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步驗(yàn)證提供了新的線索。

在GO通路富集和KEGG通路富集分析結(jié)果中，“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)能夠調(diào)節(jié)血液循環(huán)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等生物功能，亦可調(diào)控cAMP信號(hào)通路、類(lèi)固醇激素的合成、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等。血液循環(huán)在OP的發(fā)生、發(fā)展變化過(guò)程中起著重要作用。Qiu等[27]探討血液循環(huán)與骨密度丟失關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白與OP的發(fā)生有關(guān)，其水平的高低與骨密度呈正相關(guān)，提示可能與促紅細(xì)胞生成素(EPO)在骨重建中的作用、組織缺氧、酸性物質(zhì)堆積等因素相關(guān)[28-29]。細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+([Ca2+]i)具有第一信使的作用，可參與調(diào)控成骨細(xì)胞的骨形成，并在維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[30-31]。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，淫羊藿苷通過(guò)激活cAMP/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨，通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和促進(jìn)PKA和CREB磷酸化激活成骨細(xì)胞的cAMP/PKA/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。用cAMP合成腺苷酸環(huán)化酶(AC)抑制劑和PKA抑制劑阻斷cAMP/PKA/CREB信號(hào)傳導(dǎo)，可明顯抑制淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞的成骨作用[32]。目前尚無(wú)神經(jīng)活性配體-受體相互作用和OP的相關(guān)報(bào)道，但神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)共同調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，這主要依靠各種神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素等作為介質(zhì)發(fā)揮協(xié)同作用。NEI網(wǎng)絡(luò)可通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)實(shí)現(xiàn)對(duì)OP的免疫調(diào)節(jié)作用[33-34]。

綜上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可預(yù)測(cè)“淫羊藿-熟地黃”藥對(duì)治療OP的潛在靶點(diǎn)、生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路，揭示其治療OP的作用機(jī)制，對(duì)今后開(kāi)展相關(guān)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了參考和依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)主要通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病名稱(chēng)進(jìn)行檢索，本研究對(duì)骨質(zhì)疏松癥具體證型未進(jìn)行細(xì)化探討。后期的研究中需對(duì)疾病及其分型進(jìn)行深入探索，以辨證為綱，進(jìn)一步理解病與證間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和中醫(yī)臨床證候進(jìn)行有效整合，構(gòu)建病證結(jié)合網(wǎng)絡(luò)模型，為病證結(jié)合研究提供新的思路與方法。