李祥 程婷 汪瀚 汪美霞 楊文明 胡建鵬

1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230038

2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

3.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038

4.安徽醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，安徽 合肥 230012

肝豆狀核變性(Wilson disease，WD)是一種神經系統(tǒng)常染色體隱性遺傳病，主要病理特點為銅代謝異常，是全球為數(shù)不多的能夠進行有效診治的遺傳疾病。在骨骼、肝、角膜、心臟、腦及腎等組織器官內會積聚過多的銅，產生骨關節(jié)損傷、肝硬化、角膜K-F環(huán)、心功能損傷、椎體外系癥狀等臨床表現(xiàn)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學對WD的肝臟、大腦等臟器和組織受損的病因病理、臨床研究關注頗高，有研究顯示WD骨骼肌病變誤診率高達10 %，占比超過該病總誤診率的1/4，常因誤診誤治加重病情[2]。有關文獻顯示WD骨關節(jié)損害的發(fā)生率為18 %～80 %不等，表明WD的骨關節(jié)損害并非罕見，臨床上應重視該病的骨代謝障礙癥狀。相關專家將文獻資料歸納總結后得出WD患者廣泛存在骨關節(jié)損傷，都有一定程度骨質疏松、骨密度下降等變化，容易導致軟骨炎、骨關節(jié)炎、骨質碎片化、關節(jié)鈣化灶、局限性脫礦物質、骨畸形、骨折等[3-4]。本團隊前期大量的臨床和基礎研究顯示肝豆靈片可以有效改善肝豆狀核變性病情，且不良反應較小。現(xiàn)觀察比較肝豆靈片治療WD骨代謝障礙患者前后臨床癥狀、細胞因子及骨代謝生化指標的變化，探討肝豆靈片療效和WD骨代謝障礙可能機制，為本病診斷和治療提供一定借鑒。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2018年3月至2018年10月入住我院腦病三科符合WD納入標準的44例患者病例資料，男11例，女23例，年齡10～40歲，平均(21.5±8.0)歲；病程6～360個月，平均(82.1±80.8)個月。44例WD患者中15例出現(xiàn)了腕、踝、膝、髖關節(jié)程度不一的疼痛；6例伴發(fā)不同程度的關節(jié)畸形，以雙下肢、雙前臂遠端或末端明顯，日?；顒虞^受限；10例患者常常自覺雙前臂、雙下肢乏力明顯；13例患者無明顯骨代謝障礙不適癥狀。另有30例體健的志愿人員加入本研究(健康組)，有12例男性，18例女性，平均年齡為(24.0±7.1)歲。在年齡及性別等層面，治療組與健康組沒有明顯差別，可以進行對比。在整個研究中沒有一個受試者中途脫落，入組的全部病例都順利完成治療。

1.2 診斷標準與中醫(yī)辨證分型診斷標準

1.2.1WD西醫(yī)診斷標準[5]：①有肝病病史或椎體外系病史，或者同時具有以上兩種病史；②血清銅藍蛋白明顯下降；③眼科會診提示角膜K-F環(huán)(+)；④親屬患有或曾患有WD，有家族史。①、②為確診的必備條件，再加上③、④中任何一條就可確診。

1.2.2骨代謝障礙的診斷標準(Z值)[6]：①骨量低：Z小于-2；②骨量減少：骨密度值下降1至2.5個標準差；③骨質疏松：骨密度至少下降2.5個標準差；④嚴重骨質疏松：除了滿足第③外，還需伴有至少一處骨折。以上骨密度值均與同性別且同種族的正常成人骨峰值比較，出現(xiàn)以上任一征象者示為異常。

1.2.3WD中醫(yī)證候診斷標準[7]：當痰瘀互結證與肝腎虧虛證二者的中醫(yī)證候積分值≥20分時，可以確診[8]。

1.2.4納入標準：①經西醫(yī)診斷，確診為WD及骨代謝障礙；②經中醫(yī)診斷，確診為肝腎虧虛型或痰瘀互結型；③年齡10～40歲(不包括10歲和40歲)；④通過安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，受試者或監(jiān)護人自愿簽署知情同意書；⑤就醫(yī)前2周沒有進行任何專業(yè)系統(tǒng)的驅銅治療，同時未有其他影響骨代謝的疾病服藥史，未有骨質疏松、骨折等病史。

1.2.5排除、脫落標準：①年齡小于等于10歲或大于等于40歲；②就診前2周已使用明確影響代謝的藥物；③沒有依據(jù)規(guī)定診治沒有辦法判定治療效果的患者；沒有按時定期隨訪者。在分析病例時將脫落病例剔除，不進行分析。

1.3 治療方法

1.3.1入組44例患者及30例體健的志愿人員均于入組次日早晨空腹采靜脈血6 mL，經離心機(金壇市精達儀器制造有限公司，型號：精達80-2)離心(3 500 r/min，15 min)后，取上層血清3 mL置于-20 ℃冰箱中保存。采集后進行血清銅、銅藍蛋白、銅氧化酶、生化、UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、雙能X骨密度(含雙前臂、雙股骨、腰椎L1-L4)測定，骨轉化生化標志物及細胞因子指標檢測。另囑患者入院次日早晨7時排空尿液，留取24 h尿液并記錄總量，取5 mL檢測，4個治療周期后復查24 h尿銅。

1.3.244例患者均在入院后進行中醫(yī)望、聞、問、切，詳細采集患者癥狀、體征、舌苔、脈象，按照診斷標準進行辨證分型、臨床分型。①基礎治療：DMPS 20 mg/(kg·d)(規(guī)格0.125 g/2 mL，批號：120903，上海禾豐制藥有限公司)溶于5 %葡萄糖注射液250 mL緩慢靜滴 qd，連續(xù)6 d為1個療程，每個療程之間間隔2 d。同一時間口服1# qd、4個療程的鈣爾奇碳酸鈣D3片(江蘇惠氏制藥有限公司，國藥準字 H10950029，規(guī)格：每片包含600 mg的鈣與125 IU的維生素D3)。②肝豆靈組：在基礎治療的同時服用肝豆靈(安徽省中醫(yī)院制劑中心提供，經該院主管藥師萇鳳錦鑒定為正品，由大黃、丹參、莪術、金錢草等組成)，早晚各150 m L溫服，連續(xù)4個療程。

1.4 觀察指標及方法

觀察治療前后血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1，比較治療前后24 h尿銅、UWDRS評分、中醫(yī)證候積分，觀察不良反應等。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 健康受試者與 WD骨代謝障礙患者骨代謝、細胞因子指標比較

健康受試者與WD骨代謝障礙患者血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1比較。見表1。

表1 健康受試者與 WD骨代謝障礙患者骨代謝、細胞因子指標比較

根據(jù)表1可以看出：WD組病患的IGF-1、IL-10、1,25-(OH)2D3及血Ca水平比健康組顯著減少，且兩組程度比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 WD骨代謝障礙患者兩組治療前后骨代謝生化指標、細胞因子指標變化

WD骨代謝障礙患者兩組治療前后骨代謝生化指標、細胞因子指標變化，見表2。

表2 兩組治療前后骨代謝生化指標、細胞因子指標變化

表2數(shù)據(jù)提示，兩組組內進行對比，對照組在治療后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1水平與治療前相比顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IL-4與治療前相比減少并差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；BGP、BAP、TNF-α與診治前相比均減少，IL-10與診治前相比有所升高，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝豆靈組療后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1較療前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均較療前降低，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IL-10較療前升高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組療后比較，肝豆靈組血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1、IL-4、BGP、BAP、TNF-α變化均較對照組差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 WD骨代謝障礙患者兩組治療前后UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、尿銅值比較

WD骨代謝障礙患者兩組治療前后UWDRS評分、中醫(yī)證候積分、尿銅值比較，見表3～表5。

表3 兩組UWDRS分值變化分)

表4 兩組中醫(yī)證候積分變化分)

表5 兩組24 h尿銅變化

表3數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的UWDRS分數(shù)均小于診治前，變化程度差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，肝豆靈組UWDRS分數(shù)與對照組進行比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的中醫(yī)證候分數(shù)和診治前相比均有減少，變化程度差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，肝豆靈組中醫(yī)證候積分與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表5數(shù)據(jù)提示，4個周期后兩組患者的24 h尿銅值和診治前相比均有減少，變化程度差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，肝豆靈組24 h尿銅值與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 WD骨代謝障礙患者兩組治療期間不良反應的觀察

WD骨代謝障礙患者兩組治療期間的不良反應，見表6。

表6 兩組不良反應發(fā)生情況比較(n)

表6顯示，兩組治療過程中均有不良反應出現(xiàn)，以低熱、皮疹出現(xiàn)比例最高，肝豆靈組不良反應發(fā)生率(11.11 %)明顯低于對照組(23.07 %)。

3 討論

綜合文獻分析得出骨質疏松癥、佝僂病、早期骨關節(jié)炎、骨質軟化、骨畸形等是WD骨代謝障礙的常見特征，但目前臨床上這種臨床表現(xiàn)很少引起醫(yī)生重視，誤診率較高。2009年WD全球評估量表，把骨骼和肌肉損傷表現(xiàn)列為診斷WD四個主要癥狀群之一[9]。Bhatnagar等[10]報告一位患有股骨頸病理性骨折3個月的12歲女孩，后診斷為WD。因此如果兒童或青少年出現(xiàn)無法解釋的肌肉骨骼問題，應考慮該病。骨密度約反映骨強度的70 %，WD其生物化學特征是各種組織器官中細胞內銅濃度的增加，WD合并骨質疏松的特征是骨密度減低、微結構退化和骨折風險增加。WD骨代謝障礙患者如果長期得不到正確診治，可引起骨骼肌肉系統(tǒng)的不可逆損傷，對患者造成肢體功能殘障等嚴重不良后果，因此對于WD合并骨代謝障礙早期診斷并予以有效治療尤為關鍵和必要，有利于防止進一步的功能障礙。

人體vitD2、vitD3 在體內氧化形成25-(OH)D3后變化成具有完全活性的1,25-(OH)2D3。本研究發(fā)現(xiàn)WD患者血Ca和1,25-(OH)2D3較健康組明顯減低，推測很大程度上由于體內的羥化酶活性降低導致WD患者1,25-(OH)2D3合成不足。WD中的游離銅毒性較大，可能增加氧化應激標志物的應激性增高，產生細胞組織器官的毒性損傷，氧化應激的增加可能會導致炎癥細胞因子在死亡信號的級聯(lián)傳導活動[11]。IL-4主要由活化的T細胞、肥大細胞產生，可通過抑制OC前體轉化為OC，從而發(fā)揮抑制骨破壞作用。IL-10作為細胞因子中的干擾素家族功能比較多的一類負性調節(jié)因子，可以明顯地抑制Th1細胞產生IFN-γ和IL-2等，能夠明顯減少破骨細胞的聚合性以及活化程度。TNF-α的生物活性十分活躍，在某角度上可以加快骨吸收，加快骨相關細胞凋亡速度。骨堿性磷酸酶(BAP)、骨羧基谷氨酸蛋白(BGP)直接反映骨密度、微結構退化程度。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)作為活性蛋白多肽物質，有著加快骨的合成代謝，確保體內正常結構功能不受到影響的作用，增大成骨細胞的堿性磷酸酯酶的活性程度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)WD骨代謝障礙患者骨密度異常，臨床骨關節(jié)損害表現(xiàn)不一，其血清BGP、BAP、IL-4、TNF-α水平升高，IL-10、IGF-1水平降低。通過肝豆靈片治療后上述骨代謝指標和細胞炎性因子均有變化，其中血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1較治療前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均較治療前降低，表明肝豆靈片可影響肝豆狀核變性患者體內細胞因子和炎性介質。

肝豆靈是依據(jù)新安醫(yī)學腦病方面特有的中藥方劑理論和特色，創(chuàng)制的特色院內制劑。方中郁金芳香疏肝、解郁化濁、清心涼血；姜黃活血行氣；黃連清濕熱；莪術活血行氣；丹參、雞血藤活血養(yǎng)血，通經利絡；大黃清熱解毒、通腑利濕；諸藥合理搭配，共奏活血化瘀、疏肝利膽、祛痰排銅之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)郁金具有抗炎止痛，減輕炎性反應的作用[13]；姜黃具有抑制腎組織氧化損傷，保護腎臟結構的作用[14]；莪術能抑制血管內皮生長因子的表達，降低尿酸、尿素等，減輕腎組織的纖維化進展程[15-16]；丹參酮ⅡA能抑制腎氧化應激反應，延緩腎組織損傷作用[17]；金錢草是保護治療腎臟疾病的重要中藥之一，具有降低血尿素和多種氨基酸的含量, 逆轉部分腎損傷潛在標志物的相對含量，可能與金錢草總黃酮抑制腎損傷氧化應激和抑制骨橋蛋白的表達有關[18]；澤瀉能抑制腎小球損傷，減輕腎小管變性，抑制腎炎、腎病綜合征等并發(fā)癥的發(fā)生[19]。

肝豆狀核變性屬于遺傳性疾病，中醫(yī)認為遺傳性疾病本質是先天腎精不足，腎的“藏精，主生長、發(fā)育、生殖”功能受損。WD病機是先天腎精不足，加上銅毒侵襲，導致肝、脾等臟器受損，最終表現(xiàn)為肝、脾、腎俱虛的臨床癥狀[20]。本研究提示肝豆靈片能夠對肝豆狀核變性骨代謝障礙具有調節(jié)的作用，經過對細胞因子介導的炎癥反應的影響，從而對肝豆狀核變性患者的骨代謝受損有著治療效果，可以在臨床中推廣使用。