劉雯 侯晨輝 李江

1 鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州 451460

2 河南省天然藥物提取和醫(yī)療技術(shù)應(yīng)用工程研究中心，河南 鄭州 451460

據(jù)統(tǒng)計，我國骨質(zhì)疏松癥患者已超9 000萬，其中約60 %～70 %為絕經(jīng)后婦女[1]。目前治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物有生長激素類藥物、氟化物等，此類藥物雖然可調(diào)節(jié)骨代謝，但副作用明顯[2]。有文獻(xiàn)[3]報道益腎補(bǔ)骨湯對骨質(zhì)疏松癥有效且安全。BMP/Smads通路在骨形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，BMP-2可通過Smads調(diào)控下游靶基因Runx 2，Runx 2是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)骨形成[4]；OPG/RANKL/RANK則是骨吸收的經(jīng)典調(diào)控通路，可抑制破骨細(xì)胞的活性，減少骨吸收[5]。本研究將基于上述通路，研究益腎補(bǔ)骨湯對去卵巢大鼠骨代謝的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

61只8～10周齡SPF級SD雌鼠，體重180～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0001]；尼爾雌醇購自廊坊高博京邦制藥有限公司(20160428)；中藥材均購自同仁堂大藥房；大鼠血清BALP(20180805)、BGP(20180121)、PINP(20161114)、TPACP5b(20180215)、NTX-Ⅰ(20180314)試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；HE染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(20180624)；RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Promega公司(20 160 620 A、20170518B)；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)預(yù)混液購自美國RBGPhe公司(Y161121)；NMP-2(180528)、Smad-1/5/8(170630)、磷酸化Smad-1/5/8(p-Smad1/5/8，181205)、Runx 2(170712)、OPG(190415)、RANKL(181113)、RANK(181012)一抗及二抗均購自美國Cell Signaling公司；引物合成委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行。

Mk3酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；MM-7金相光學(xué)顯微鏡購自上海光學(xué)儀器一廠；RZ-Digumus小動物雙能X線骨密度儀購自美國Kubtec公司(精確度誤差為 1.5%)；HHQ-3558石蠟切片機(jī)購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；165-8001小型垂直電泳儀購自美國伯樂公司；7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1益腎補(bǔ)骨湯制備：中藥材經(jīng)過鑒定，按方稱取，常規(guī)水煎后去渣取汁，每毫升分別含生藥1.34、2.68、5.36 g，經(jīng)指紋圖譜鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2.2建模及分組：隨機(jī)取51只大鼠建立去卵巢大鼠模型。經(jīng)腹腔麻醉，暴露大鼠雙側(cè)卵巢組織并切除。余下10只記作假手術(shù)組，不切除卵巢。兩個月后，于建模大鼠中隨機(jī)選1只取其右側(cè)脛骨，實施HE染色，病理評分若≥2分則認(rèn)為建模成功，其中基本正常、偶見輕微病變、病變范圍≤1/4視野、>1/4視野且≤1/2視野、>1/2視野分別記為0、1、2、3、4分。將建模大鼠隨機(jī)分為5組，其中尼爾雌醇組給予1.5 mg/kg尼爾雌醇(溶于1 mL/100 g生理鹽水)灌胃，高劑量益腎補(bǔ)骨湯組給予高劑量(含生藥5.36 g/mL)益腎補(bǔ)骨湯1 mL/100 g灌胃，中劑量益腎補(bǔ)骨湯組給予中劑量(含生藥2.68 g/mL)益腎補(bǔ)骨湯1 mL/100 g灌胃，低劑量益腎補(bǔ)骨湯組給予低劑量(含生藥1.34 g/mL)益腎補(bǔ)骨湯1 mL/100 g灌胃，模型組和假手術(shù)組均給予1 mL/100 g生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)3個月。采用雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨、脛骨骨密度(bone mineral density, BMD)值；采用酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒測得大鼠尾靜脈血血清骨代謝水平。

1.2.3大鼠骨組織骨代謝相關(guān)基因表達(dá)水平檢測：取大鼠左側(cè)脛骨組織，使用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取脛骨中總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI上查詢的基因序列，設(shè)計出上下游引物。退火溫度為56 ℃，35個循環(huán)，計算2-△△Ct。

1.2.4大鼠骨組織骨代謝相關(guān)蛋白表達(dá)及p-Smad1/5/8水平檢測：取大鼠左側(cè)脛骨組織，研磨加入細(xì)胞裂解液。蛋白上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，更換二抗，室溫孵育2 h。顯色、分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 模型驗證

建模大鼠脛骨組織HE染色病理評分為4分，表明建模成功，見圖1。

圖1 建模大鼠脛骨組織骨小梁HE染色(×200)

2.2 各組大鼠骨密度對比

模型組骨密度低于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組的骨密度均高于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠骨密度對比

2.3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)對比

治療后模型組血清BALP、BGP和PINP水平均低于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均高于模型組(P<0.05)；模型組TPACP5b和NTX-I水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)對比

2.4 大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組脛骨骨細(xì)胞排列有序，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整；模型組骨內(nèi)膠原纖維明顯紊亂，骨小梁變細(xì)，數(shù)量減少，并出現(xiàn)斷裂；尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯高、中、低劑量組均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其中益腎補(bǔ)骨湯高劑量組骨膠原纖維排列較整齊，骨小梁厚度、骨連續(xù)性均與假手術(shù)組較為接近，見圖2。

圖2 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×40)

模型組病理評分高于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均低于尼爾雌醇組(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠骨組織病理評分對比

2.5 大鼠骨組織相關(guān)基因表達(dá)對比

大鼠骨組織BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA表達(dá)水平比較：模型組低于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均高于模型組(P<0.05)；模型組RANKL、RANL mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均低于模型組(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠骨組織相關(guān)基因表達(dá)對比

2.6 大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平對比

模型組BMP-2、Smad-1/5/8、Runx2、OPG蛋白表達(dá)及p-Smad1/5/8水平均低于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均高于模型組(P<0.05)；模型組RANKL、RANL 蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.05)，尼爾雌醇組和益腎補(bǔ)骨湯三個劑量組均低于模型組(P<0.05)。見圖3、表5。

表5 大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平比較

圖3 大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平檢測(WB)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥是由肝腎虧虛、瘀血阻滯所致。益腎補(bǔ)骨湯主要成分有黃芪、鹿角霜、葛根、當(dāng)歸、淫羊藿等。黃芪可補(bǔ)氣固表；鹿角霜可溫腎助陽；葛根可升陽解熱；當(dāng)歸可益氣健脾，活血化瘀；淫羊藿可補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨。主要聯(lián)用可補(bǔ)腎健脾、活血化瘀、強(qiáng)筋健骨[7]。因此本研究觀察益腎補(bǔ)骨湯治療去卵巢大鼠骨代謝水平具有可行性。

BALP可以反映成骨細(xì)胞活性，有研究[8]表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性血清檢測到BALP水平降低；BGP由成骨細(xì)胞分泌，是反應(yīng)成骨細(xì)胞功能的標(biāo)志物[9]；PINP源于Ⅰ型前膠原，是Ⅰ型膠原蛋白合成過程中從Ⅰ型前膠原上剪切的產(chǎn)物，可反映Ⅰ型膠原蛋白合成水平和新骨形成水平[10]；TPACP5b主要由破骨細(xì)胞分泌，可抵抗酒石酸抑制[11]；NTX-I是膠原降解標(biāo)志物，其水平與骨吸收活性呈正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，益腎補(bǔ)骨湯可改善骨代謝水平，還可減輕骨組織病變。

BMP-2屬于TGF-β超家族成員，正常情況下在骨組織中高表達(dá)。Smad1/5/8是BMP下游信號分子。當(dāng)BMP信號被激活時會將下游Smad1/5/8磷酸化，引起p-Smad1/5/8核位移，進(jìn)一步調(diào)控下游靶基因Runx 2表達(dá)水平[13]。Runx 2基因表達(dá)與骨基質(zhì)蛋白形成有關(guān)，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Runx 2基因可導(dǎo)致骨形成指標(biāo)水平均上調(diào)。OPG又稱為破骨細(xì)胞抑制因子，屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，其活性下降意味著對破骨細(xì)胞活性的抑制作用減弱，可增加骨吸收，同時其下游的RANKL、RANK活性增強(qiáng)，放大破骨細(xì)胞的生物學(xué)活性，進(jìn)而增加骨吸收[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益腎補(bǔ)骨湯可上調(diào)骨組織BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA和蛋白表達(dá)水平，增加p-Smad1/5/8水平升高，還可下調(diào)RANKL、RANK表達(dá)，推測是通過調(diào)控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路實現(xiàn)對骨代謝的調(diào)節(jié)作用的。

綜上所述，益腎補(bǔ)骨湯可增強(qiáng)去卵巢大鼠骨密度，改善骨組織病變，推測其機(jī)制可能與調(diào)控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路有關(guān)。