王雪晴,郝愛(ài)月,譚新柳,張立慧,梅艷珍,戴傳超,明燈明,黃 菲,楊雅瓊

(1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210046;3.南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210046)

牛奶因其營(yíng)養(yǎng)豐富,易于消化,便于食用,而成為人類(lèi)理想的天然食品。常喝牛奶有助于身體的發(fā)育,補(bǔ)足鈣質(zhì)需求量,減少骨骼萎縮,降低骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生概率。然而,隨著乳及乳制品行業(yè)的快速發(fā)展,抗生素被大量應(yīng)用于畜牧業(yè)中,其根本目的是為了保障動(dòng)物的健康以及畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,但也不可避免地造成了乳制品中抗生素的殘留[1]。乳與乳制品中抗生素的種類(lèi)主要包括:四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)以及氨基糖苷類(lèi)等,因其可以有效預(yù)防和治療人類(lèi)和動(dòng)物的傳染病,而在人類(lèi)醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中受到極大關(guān)注,被廣泛用作食品添加劑以及治療畜牧業(yè)中的細(xì)菌感染性疾病。牛奶中的抗生素殘留是全世界奶牛業(yè)普遍存在的問(wèn)題,這是因?yàn)槟膛?chǎng)均用抗生素類(lèi)藥物治療奶牛疾病,如奶牛的乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎或其他炎癥性疾病。據(jù)調(diào)查,在我國(guó)臨床型奶牛乳腺炎發(fā)病率占牛乳腺炎總發(fā)病率的21%～23%[2]。

奶牛在飼養(yǎng)過(guò)程中會(huì)經(jīng)常性地感染大量有害病菌。例如:乳牛食入了被農(nóng)藥或放射性物質(zhì)污染的飼料和水。而飼養(yǎng)牛奶的農(nóng)戶(hù)為促進(jìn)牛體正常生長(zhǎng)并且要治療疾病,就會(huì)通過(guò)注射或者飼喂等方式對(duì)乳牛使用一些激素和抗生素。這些激素、抗生素、放射性物質(zhì)和農(nóng)藥就會(huì)通過(guò)牛機(jī)體而進(jìn)入牛乳中,對(duì)牛乳造成污染。除此之外,為了保證新鮮獲取的牛乳不被細(xì)菌污染,也會(huì)在牛乳中加入抗生素來(lái)抗菌,這些都是牛乳中可能存在抗生素殘留的原因。Vieira等[3]的實(shí)驗(yàn)證明：即使牛乳中含有微量的抗生素,也可導(dǎo)致人體對(duì)抗生素產(chǎn)生過(guò)敏或增加抗藥性,因此對(duì)大眾健康有害,同時(shí)影響發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。為此,了解乳與乳制品抗生素殘留的來(lái)源、類(lèi)別以及危害,實(shí)現(xiàn)乳與乳制品中抗生素殘留檢測(cè)成為當(dāng)前食品安全檢測(cè)的當(dāng)務(wù)之急。

1 乳及乳制品中殘留的抗生素

幾十年來(lái),抗生素藥物特別是四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗生素是乳與乳制品中抗生素殘留的主要類(lèi)別[4]。

四環(huán)素類(lèi)藥物屬于一個(gè)抗生素大家族,它的首批成員來(lái)自放線(xiàn)菌的鏈霉菌屬。1944年從金色鏈霉菌中分離出金霉素,幾年后,分別從龜裂鏈霉菌和金霉素鏈霉菌中分離出土霉素和地美環(huán)素,金霉素氫解后生成四環(huán)素[5]。20世紀(jì)60年代初,人們開(kāi)發(fā)出了多西環(huán)素,它是土霉素的半合成衍生物[5]，2005年又合成出替加環(huán)素。這一類(lèi)廣譜抗生素,能抑制蛋白質(zhì)合成,使藥物可逆地與敏感菌的核糖體30S亞基結(jié)合,阻礙氨基酰tRNA與mRNA-核糖體復(fù)合體上的受體結(jié)合,阻止氨基酸增加到肽鏈上[6]，且對(duì)四環(huán)素類(lèi)呈抑菌活性,但是對(duì)敏感菌具有殺滅作用[6]。

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素包括青霉素族和頭孢菌素族,這類(lèi)藥物都具有殺菌活性,主要通過(guò)干擾細(xì)菌繁殖過(guò)程中肽聚糖的合成來(lái)發(fā)揮效果[7]。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素主要通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合成蛋白(PBP),PBP是一種胞壁粘肽合成酶, 可以使肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸-N-乙酰葡糖胺骨干上肽鏈之間交叉連接。當(dāng)抗生素與PBP結(jié)合后,細(xì)菌細(xì)胞壁合成因缺乏交叉連接,細(xì)胞壁形成受阻,從而導(dǎo)致生長(zhǎng)細(xì)胞裂解[8]。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的敏感性差異是由于后者細(xì)胞壁上肽聚糖的含量較高,二者含有青霉素結(jié)合蛋白的量不同,使得某些β-內(nèi)酰胺類(lèi)很難滲透穿過(guò)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖層[9]。

氨基糖苷類(lèi)抗生素分為天然和半合成兩大類(lèi),天然來(lái)源的包括由鏈霉菌屬培養(yǎng)液中提取獲得的鏈霉素、卡那霉素和新霉素等；人工半合成的主要有阿米卡星、奈替米星等[10-11]。氨基糖苷類(lèi)是濃度依賴(lài)型抗菌藥物,對(duì)需氧革蘭氏陰性菌和某些革蘭氏陽(yáng)性菌有殺菌活性,但對(duì)厭氧菌幾乎沒(méi)有殺菌活性[10-11]。不同的氨基糖苷類(lèi)藥物作用稍有區(qū)別。鏈霉素及其二氫衍生物作用于核糖體上的單一位點(diǎn),但其他氨基糖苷類(lèi)則作用于多個(gè)位點(diǎn)上[12-13]。氨基糖苷類(lèi)具有殺菌作用,有劑量依賴(lài)性,而且有顯著的抗生素后效應(yīng)。雖然從理論上講,β-內(nèi)酰胺類(lèi)通過(guò)藥物干擾細(xì)胞壁的合成,從而促進(jìn)氨基糖苷類(lèi)藥物滲透進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。然而,有一些動(dòng)物用的制劑類(lèi)型,例如：氨基糖苷類(lèi)和普魯卡因青霉素鹽通過(guò)合并使用，確實(shí)可以增強(qiáng)殺菌的活性[14]。同時(shí),細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥性是通過(guò)介導(dǎo)細(xì)菌酶實(shí)現(xiàn)的,這些細(xì)菌酶可以滅活氨基糖苷類(lèi)并阻止其與核糖體結(jié)合。編碼這些酶的基因位于質(zhì)粒上,這樣便于將耐藥性迅速轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌中[15-17]。

2 乳及乳制品中抗生素殘留的危害

抗生素的危害從它對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制來(lái)分析,主要有:阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁合成,致使細(xì)胞壁缺損死亡[18];抑制細(xì)菌細(xì)胞生存所必需的蛋白質(zhì)合成[19]。首先,隨著各種抗生素在我國(guó)畜牧業(yè)中的不斷使用,一些與乳制品相關(guān)的細(xì)菌很容易產(chǎn)生耐藥性,甚至?xí)a(chǎn)生交叉耐藥性,還會(huì)通過(guò)畜禽產(chǎn)品傳染給人體,使抗生素作用大大降低,甚至無(wú)效,并導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[20]。其次，長(zhǎng)期食用含有抗生素的乳品,會(huì)破壞微生態(tài)平衡、抑制腸道菌群的正常生長(zhǎng),并產(chǎn)生耐藥性的致病菌,致使某些維生素(如維生素B族、維生素K)缺乏,機(jī)體免疫力下降[20]。最后,經(jīng)常食用含有抗生素的乳品還會(huì)導(dǎo)致敏感人群產(chǎn)生過(guò)敏癥狀,甚至?xí)?dǎo)致過(guò)敏性休克,其主要癥狀為胸悶、呼吸困難、面色蒼白、脈細(xì)弱、血壓下降、大小便失禁、昏迷和意志喪失等,嚴(yán)重者可在短時(shí)間內(nèi)死亡[20]。除此之外,抗生素殘留還有可能促使動(dòng)物體產(chǎn)生基因突變、畸形和導(dǎo)致癌癥的發(fā)生等危害[21]。

3 乳及乳制品中抗生素的檢測(cè)

2001年,我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布實(shí)施了《無(wú)公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[22],對(duì)新鮮牛乳的衛(wèi)生指標(biāo)明確了“不得抗生素檢出”的要求。但目前我國(guó)尚未能?chē)?yán)格執(zhí)行此行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),致使我國(guó)乳及乳制品中抗生素殘留問(wèn)題一直未能得到解決,引起了人們對(duì)牛奶安全問(wèn)題的擔(dān)憂(yōu)[23]。

趙杰等[24]在2013年采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)對(duì)貴陽(yáng)地區(qū)60份牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示：抗生素殘留顯示陽(yáng)性結(jié)果1份。安先霞等[25]使用TTC法對(duì)永靖縣部分奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)抽取40份生鮮乳樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示：3份樣品呈抗生素殘留陽(yáng)性,2份樣品為可疑樣品。Wang等[26]利用基于受體的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)即TetR蛋白與四環(huán)素(TC)的特異性結(jié)合，檢測(cè)50個(gè)牛奶樣品中的四環(huán)素殘留(圖1(a)),結(jié)果顯示：3個(gè)樣品被確定為陽(yáng)性；并且以TC計(jì)算的殘留水平發(fā)現(xiàn):樣品A質(zhì)量濃度為15 ng/mL;樣品B質(zhì)量濃度為18 ng/mL;樣品C質(zhì)量濃度為46 ng/mL。為了進(jìn)一步確認(rèn),使用高效液相色譜法(HPLC法)進(jìn)一步測(cè)定這些牛奶樣品[24],結(jié)果顯示:3種樣品都含有TC殘留物,其中樣品A中的TC質(zhì)量濃度為18 ng/mL;樣品B中土霉素(OTC)質(zhì)量濃度為25 ng/L;樣品C中的TC質(zhì)量濃度為41 ng/mL)。其HPLC色譜圖見(jiàn)圖1(b),由此說(shuō)明,我國(guó)乳制品殘留情況仍然存在。

圖1 (a)TetR蛋白的三維構(gòu)象與(b)TC的分子對(duì)接復(fù)合物及3種陽(yáng)性乳樣品的HPLC色譜圖[26]Fig.1 Three-dimensional conformation of TetR protein and molecular docking complex with TC (a) and HPLC chromatogram of three positive milk samples(b)[26]

4 乳及乳制品中抗生素殘留檢測(cè)方法

隨著食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到重視,食品安全檢測(cè)技術(shù)也在近些年來(lái)迅速發(fā)展,已經(jīng)有許多便捷快速且靈敏度高的方法應(yīng)用于乳及乳制品的抗生素殘留檢測(cè)中,主要有：微生物檢測(cè)法、理化檢測(cè)法、免疫分析法等。

4.1 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法的測(cè)定原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物生理機(jī)能、代謝的抑制作用來(lái)定性確定樣品中抗微生物藥物的殘留,可以用作篩選技術(shù),預(yù)先篩選可能存在的抗生素殘留物[27]。但是其結(jié)果誤差大,測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),而且如果僅使用微生物檢測(cè)法來(lái)鑒定,也很可能出現(xiàn)不可測(cè)量的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。微生物檢測(cè)法主要有氯化三苯基四氮唑法(TTC)、戴爾沃試劑盒法和瓊脂擴(kuò)散法等[28]。

4.1.1 氯化三苯基四氮唑法(TTC)

TTC法的原理是基于抗生素對(duì)微生物的抑制作用,最初是由Berridge[29]發(fā)明,將嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基和酸堿顏色指示劑溴甲酚紫添加到牛奶樣品中,在孵育樣品期間,每30 min測(cè)定一次顏色,指示劑變色的時(shí)間可作為衡量抗菌藥物在牛奶中殘留濃度的一個(gè)指標(biāo)。Galesloot等[30]利用嗜熱鏈球菌和亞甲基藍(lán)作為指示劑,進(jìn)一步優(yōu)化了酸堿指示劑,發(fā)現(xiàn)牛奶中青霉素G殘留檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到1 μg/L。

Hyun等[31]采用TTC法對(duì)奶牛場(chǎng)常用的5種磺胺類(lèi)抗生素和2種喹諾酮類(lèi)抗生素進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果為磺胺喹惡啉、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲氧嘧啶最低檢測(cè)質(zhì)量濃度均為25 μg/L,磺胺二甲嘧啶和磺胺甲嘧啶最低檢測(cè)質(zhì)量濃度均為50 μg/L,而兩種喹諾酮類(lèi)抗生素由于含量極低，并沒(méi)有通過(guò)TTC法檢測(cè)出來(lái)。Eftychia等[32]用微生物抑制法，快速檢測(cè)牛乳中的10種抗生素,其中青霉素的最低檢測(cè)限為4 μg/L,符合國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。陳芳[33]將TTC法與MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)兩種分析方法進(jìn)行對(duì)比,用于牛奶中青霉素和鏈霉素殘留檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)兩種方法結(jié)果一致,不加青霉素或鏈霉素的陰性試管內(nèi)的乳液變成紅色,加不同濃度的青霉素或鏈霉素的陽(yáng)性試管內(nèi)的乳液未變色,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)可知：加青霉素的陽(yáng)性試管和不加青霉素的陰性試管,從左到右的濃度分別為加青霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL;圖2(b)為加鏈霉素的陽(yáng)性試管和不加鏈霉素的陰性試管,從左到右的濃度分別為加鏈霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL。

圖2 (a)TTC法檢測(cè)青霉素和(b)鏈霉素的試驗(yàn)結(jié)果[33]Fig.2 Test results of penicillin test by TTC method (a) and test results of streptomycin test by TTC method (b)[33]

4.1.2 戴爾沃試劑盒法(Delvo-X-PRESS)

Delvo-X-PRESS(DSM Food Specialties)是一種基于酶的快速檢測(cè)方法,是為檢測(cè)奶罐和奶倉(cāng)中β-內(nèi)酰胺類(lèi)殘留而專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的,只需幾分鐘就可以檢測(cè)出結(jié)果[34]。Delvo-X-PRESS是一種基于受體-酶的競(jìng)爭(zhēng)性、定性檢測(cè)方法[34]。受體蛋白來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌,能夠特異性識(shí)別出多種β-內(nèi)酰胺類(lèi),BCP(溴甲酚紫)用于指示反應(yīng)信號(hào),根據(jù)顏色反應(yīng)(特異性生成黃色)可以判斷是否含有β-內(nèi)酰胺類(lèi)殘留,檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼或者自動(dòng)化的讀數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行判斷,整個(gè)檢測(cè)耗時(shí)在10 min以?xún)?nèi)[34]。

崔晨光[34]采用戴爾沃試劑盒法對(duì)三元純牛奶和奶罐生鮮乳樣本中青霉素G和磺胺嘧啶兩種抗生素進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：三元純牛奶作為對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性,奶罐生鮮乳檢測(cè)結(jié)果為陰性,說(shuō)明隨機(jī)抽取的奶罐生鮮乳是合格的。青霉素G濃度在1 μg/L時(shí),采用戴爾沃牛奶廣譜抗生素檢測(cè)試劑盒即可檢出,而其對(duì)磺胺類(lèi)藥物也很敏感,在20 μg/L時(shí)即可檢出,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 (a)青霉素G檢測(cè)結(jié)果和(b)磺胺嘧啶檢測(cè)結(jié)果[34]Fig.3 Penicillin G test results(a) and sulfadiazine test results (b)[34]

4.1.3 瓊脂擴(kuò)散法

瓊脂擴(kuò)散方法(agar diffusion method)的原理是通過(guò)測(cè)定瓊脂平皿上標(biāo)準(zhǔn)受試微生物抑菌圈的大小,是一種目前應(yīng)用最為廣泛的篩選技術(shù)[35-36]。孵育過(guò)程中,液體樣品會(huì)擴(kuò)散到瓊脂培養(yǎng)基的基質(zhì)中。孵育一段時(shí)間后(在8～36 h之間,確切時(shí)間取決于具體試驗(yàn)),測(cè)量抑菌圈的大小。如果存在的抗菌濃度超過(guò)一定的限度,微生物生長(zhǎng)會(huì)被抑制(微生物死亡/生長(zhǎng)受抑制),在瓊脂平皿上可見(jiàn)清晰的抑菌圈,詳見(jiàn)圖4。該方法是檢測(cè)牛乳中抗生素殘留最傳統(tǒng)的方法[37-38]。

圖4 瓊脂擴(kuò)散法[36]Fig.4 Agar diffusion method[36]

4.2 理化檢測(cè)法

4.2.1 反相液相色譜法

抗菌藥物分析最常用的是反相液相色譜(RPLC),RPLC固定相(3.5 或5.0 μm顆粒)由非極性或疏水性有機(jī)填料(如辛基、十八烷基、苯基或氰基基團(tuán))通過(guò)硅氧烷(甲硅烷基醚)鍵(—Si—O—Si—)附著在硅基載體的表面而形成[39]?；瘜W(xué)鍵合十八烷基硅烷(ODS、C18)或18個(gè)碳原子的烷烴是最常用的固定相;較短烷基鏈鍵合的色譜柱如C8、苯基或氰丙基鍵合相的非極性較小,偶爾可作為替代;反相填料的表面是疏水性的,其保留機(jī)制是疏水性、分配和吸附作用[40]。大多數(shù)抗菌藥物在反相色譜柱上的保留和分離情況良好,但氨基糖苷類(lèi)化合物和林可霉素除外,需要使用離子對(duì)試劑或親水作用色譜(HILIC)來(lái)分析[41]。RPLC流動(dòng)相由乙腈或甲醇、水和修飾劑組成。RPLC的保留程度和選擇性很大程度上取決于流動(dòng)相的性質(zhì)和組成、pH調(diào)節(jié)劑和流動(dòng)相的離子強(qiáng)度[42]。

Han等[43]利用HPLC技術(shù)檢測(cè)了牛奶中36種抗生素的殘留情況,結(jié)果表明：以3和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.01～5 和0.03～10 μg/kg。所有分析物的LOQ遠(yuǎn)低于中國(guó)和歐盟規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),適用于牛奶中抗生素殘留的痕量分析。

4.2.2 高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)是液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的儀器。液相色譜流動(dòng)相的組成以及緩沖液或添加劑的濃度和pH,對(duì)抗菌藥物的最佳電離效率、離子噴射穩(wěn)定性和色譜分離至關(guān)重要。如何選擇合適的溶劑取決于需要分析的化合物的性質(zhì)、采取的電離方法和所用的色譜柱[44-46]。LC-MS流動(dòng)相最合適的溶劑是水、甲醇和乙腈。甲醇比乙腈柱后壓高。LC梯度洗脫過(guò)程中,柱后壓隨著流動(dòng)相的黏性變化而呈比例變化。甲醇和水混合液比純甲醇或純水黏性大,40%甲醇水的黏性達(dá)到最大,為1.62 mPa/s[44]。然而,乙腈和水混合時(shí),當(dāng)乙腈比例增加時(shí),黏度下降。在一些條件下,如反相液相-大氣壓化學(xué)離子源色譜(LC-APCI)或液相大氣壓光電離子源(LC-APPI),以及分析一些質(zhì)子親和力相對(duì)較低的分析物時(shí),最好用甲醇來(lái)提高離子化效率,因?yàn)榧状嫉馁|(zhì)子親和力(PA)低于乙腈。例如：采用LC/APCI-MS(液相色譜-大氣壓化學(xué)離子源-質(zhì)譜聯(lián)用)分析質(zhì)子親和力較低的甾體類(lèi)化合物時(shí),甲醇優(yōu)于乙腈[45]。

Wang等[46]利用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了牛奶中6種抗生素(紅霉素、青霉素G、鹽酸四環(huán)素、磺胺甲惡唑、鹽酸環(huán)丙沙星和青霉素V)的殘留情況,結(jié)果表明：6種目標(biāo)化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,R2為0.995～0.999。以3和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.4～3和0.1～0.5 μg/kg。

4.3 免疫分析法

免疫分析是指檢測(cè)抗體與抗原性分析物之間的特異性反應(yīng)的方法[47]?，F(xiàn)代免疫分析方法起源于Hummel等[18]使用抗胰島素抗體測(cè)定人血漿中激素含量的研究工作[48]。免疫分析依據(jù)檢測(cè)的是初級(jí)抗原抗體反應(yīng)或是二級(jí)反應(yīng),分為直接法和間接法兩種。免疫分析方法具有檢測(cè)限低、特異性高、操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。目前,已經(jīng)報(bào)道了多種免疫分析方法,它們各具優(yōu)缺點(diǎn)。已報(bào)道的用于獸藥殘留檢測(cè)的免疫分析方法很多,操作方法簡(jiǎn)單的有側(cè)流層析法(Later-flow devices, LFDs)和試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射性免疫分析法(RIA)等,操作復(fù)雜且需要精密儀器的免疫分析方法有基于表面等離子體共振(SRP)的光學(xué)生物傳感器法[49]。

4.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

目前,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是最常見(jiàn)的一種免疫測(cè)定法。20世紀(jì)70年代，Engvall等[50]最早建立了ELISA技術(shù)[50]。首先將抗原或抗體包被在固相材料表面,加入樣品反應(yīng)后,再通過(guò)適當(dāng)方法分離結(jié)合和未結(jié)合組分,使得ELISA可用于檢測(cè)復(fù)雜樣品中的待測(cè)物,許多現(xiàn)代的生物分析方法大多是基于傳統(tǒng)的ELISA方法建立的(圖5)[51]。

圖5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理[51]Fig.5 Enzyme linked immunosorbent assay schematic[51]

傳統(tǒng)的ELISA通常使用顯色指示劑和底物,獲得可觀測(cè)的顏色變化,大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA方法或商品化的抗菌藥物殘留檢測(cè)試劑盒均基于顯色指示劑[52-53]。最新的ELISA技術(shù)已開(kāi)始通過(guò)熒光、電化學(xué)發(fā)光和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)等來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)。這些非酶類(lèi)的指示信號(hào)具有多種優(yōu)勢(shì),如：靈敏度更高、多殘留檢測(cè)能力,微陣列檢測(cè)?，F(xiàn)在這些技術(shù)已被成功應(yīng)用于食品中抗菌藥物的檢測(cè)[54-55]。雖然許多報(bào)道的ELISA方法既可使用多克隆抗體，也可使用單克隆抗體作為捕獲識(shí)別分子,但由于雜交瘤細(xì)胞可源源不斷地產(chǎn)生均一性的單克隆抗體,因此目前基于單抗的ELISA方法呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。2005年,Samsonova等[56]采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)牛奶中青霉素的殘留,檢測(cè)線(xiàn)性質(zhì)量濃度范圍為2～32 ng/mL。

4.3.2 表面等離子體共振(SPR)生物傳感器技術(shù)

生物傳感器(Biosensor)是由生物辨識(shí)元件(BRE)和電化學(xué)轉(zhuǎn)換器構(gòu)成的,是一種可將分析物的濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的裝置。最早的生物傳感器是一種催化體系,這個(gè)體系整合了生物受體(即酶、細(xì)胞器或微生物)和轉(zhuǎn)換器,可將生物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為電子信號(hào)[57]。當(dāng)生物相互作用發(fā)生時(shí),其他物化參數(shù)也隨之發(fā)生改變,包括焓、離子電導(dǎo)率和質(zhì)量。根據(jù)這個(gè)效應(yīng),可以將生物催化作用和轉(zhuǎn)換器結(jié)合起來(lái)投入應(yīng)用[58]。光學(xué)、電化學(xué)、感溫、壓電和電磁傳導(dǎo)都是常用的傳導(dǎo)機(jī)制。

SPR與大多數(shù)免疫化學(xué)分析技術(shù)相比,具有不需要酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記目標(biāo)物或識(shí)別元件的優(yōu)點(diǎn)。SPR已經(jīng)與微流控技術(shù)相結(jié)合,可實(shí)現(xiàn)結(jié)合復(fù)合物的連續(xù)、實(shí)時(shí)監(jiān)控[59]。SPR可提供目標(biāo)分子的濃度、結(jié)合特異性、親和力、動(dòng)力學(xué)和協(xié)同效應(yīng)等信息。

4.4 常見(jiàn)抗生素殘留檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

微生物檢測(cè)法、理化檢測(cè)法和免疫分析法是目前應(yīng)用于乳及乳制品中抗生素殘留檢測(cè)的3種主要檢測(cè)方法,其各有優(yōu)缺點(diǎn)(見(jiàn)表1)。微生物檢測(cè)法是根據(jù)抗生素對(duì)微生物生理機(jī)能、代謝的抑制作用來(lái)定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留,檢測(cè)費(fèi)用較低,但是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、特異性差、靈敏度低以及結(jié)果誤差大[27]。理化檢測(cè)法是一種根據(jù)抗生素的分子理化性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分離和檢測(cè)的方法,這種方法分析速度快、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定以及準(zhǔn)確可靠,但是樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴和需專(zhuān)業(yè)操作人員操作[60-61]。免疫分析法是以抗原與抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的分析技術(shù),其操作簡(jiǎn)單、取樣量少和檢測(cè)快速,但由于其檢測(cè)面較窄、特異性抗原抗體價(jià)格較高等特點(diǎn),導(dǎo)致免疫分析法的推廣和普及還需要很長(zhǎng)的時(shí)間。

表1 常見(jiàn)抗生素殘留檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

5 結(jié)語(yǔ)

乳及乳制品中抗生素殘留問(wèn)題是涉及人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題,目前我國(guó)為了解決這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)在不斷完善乳及乳制品中抗生素殘留的限定標(biāo)準(zhǔn),科研工作者也一直在尋求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的檢測(cè)方法,使得乳及乳制品中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)的研究得到了很好的發(fā)展。微生物檢測(cè)法由于其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度差以及易產(chǎn)生誤差而很少被應(yīng)用于抗生素殘留的檢測(cè)。理化檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室常用的操作方法,其高效靈敏、應(yīng)用范圍廣,但常須要專(zhuān)門(mén)的人員進(jìn)行操作,因此不適用于乳品企業(yè)的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)。免疫分析與生物傳感器的結(jié)合是近幾年研究的熱點(diǎn),例如免疫膠體金層析技術(shù),既可達(dá)到高特異性、高靈敏度的要求,而且還有效地實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),有效地避免了儀器分析中須要專(zhuān)業(yè)人員操作的問(wèn)題,能很好滿(mǎn)足乳品企業(yè)的需求。但這種方法存在后滯現(xiàn)象,樣品使用前須進(jìn)行稀釋處理,而且易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性信號(hào)。目前很多商業(yè)化的試劑盒可以用于乳與乳制品中抗生素檢測(cè),但由于價(jià)格昂貴,大批量測(cè)試花費(fèi)巨大。隨著技術(shù)的發(fā)展,實(shí)現(xiàn)更加簡(jiǎn)單快捷、靈敏高效、多組分抗生素同步分析的檢測(cè)是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。筆者建議應(yīng)該繼續(xù)重視乳及乳制品中抗生素殘留的檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與改進(jìn),來(lái)滿(mǎn)足日趨嚴(yán)格的殘留限量檢測(cè)要求,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程的智能化、自動(dòng)化。