袁 愷，周衛(wèi)強，唐 堂，孫浩軒，楊 碩，彭 超，陳 博，盧宗梅，周 勇，李 義,3,周 哲,3，徐 晴，佟 毅,3

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室 老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；3.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033；4.南京師范大學 食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210046)

L-蘋果酸(L-malic acid，L-羥基丁二酸)是細胞代謝途徑的必需中間物，也是一種重要的四碳二元羧酸，因其具有較好的酸度和口感，被廣泛用作食品、飲料行業(yè)的酸化劑和增味劑，更被認為是傳統(tǒng)酸化劑檸檬酸的替代品。2004年，美國能源部將L-蘋果酸列為十二大基礎化學品之一。作為潛在的C4平臺化合物，L-蘋果酸又可以進一步轉化為多種用于紡織業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)領域的化學品[1]。L-蘋果酸全球市場需求量已經(jīng)達到6萬t，并且保持4%的年增長率，而L-蘋果酸的年產(chǎn)量僅為4萬t[2]。

目前工業(yè)上主要以苯為原料，通過化學合成法生產(chǎn)DL-蘋果酸，然后經(jīng)分離純化獲得L-蘋果酸。隨著公眾對全球變暖、環(huán)境污染和原油短缺的關注日益增加，通過微生物發(fā)酵法轉化可再生資源生產(chǎn)各類有機物已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸仍處于實驗室研究階段。本文中，筆者從菌株種類和合成代謝途徑分析了微生物發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的優(yōu)勢，并分別從可再生資源菌株的獲得、外部環(huán)境脅迫條件、合成代謝途徑改造和轉運能力提高4個方面詳細介紹了L-蘋果酸的優(yōu)化工藝，希望這些研究方法和改進措施能夠為微生物發(fā)酵法合成L-蘋果酸的工業(yè)化提供理論指導。

1 微生物法產(chǎn)L-蘋果酸研究現(xiàn)狀

1.1 L-蘋果酸生產(chǎn)方式

L-蘋果酸的獲得方法主要有4種：直接提取法[3-4]、化學合成法[5]、酶轉化法[6]和直接利用微生物轉化糖質或非糖質原料的微生物發(fā)酵法[7]。由于這4種生產(chǎn)方式之間的優(yōu)劣差異(表1)，目前工業(yè)上主要以化學合成法和酶轉化法生產(chǎn)L-蘋果酸。微生物發(fā)酵法成本低廉，依賴可再生資源，可以減少對石油儲備的依賴和CO2的排放，鑒于這些優(yōu)勢，國內(nèi)已有生物制造企業(yè)開始進行嘗試，如安徽豐原年產(chǎn)3萬t L-蘋果酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)線正在建設中。

表1 L-蘋果酸不同生產(chǎn)方式的優(yōu)缺點

1.2 L-蘋果酸生產(chǎn)菌株

選擇合適的菌株是實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的基礎。細菌、酵母和絲狀真菌都可以用作微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的開發(fā)平臺[8-9]。Zhang等[10]通過基因敲除將產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌KJ060改造成產(chǎn)L-蘋果酸大腸桿菌XZ658，發(fā)酵3 d后L-蘋果酸產(chǎn)量達到33.9 g/L。2008年，Zelle等[11]以釀酒酵母為平臺，過表達自身的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶和異源表達裂殖酵母的蘋果酸通透酶將L-蘋果酸產(chǎn)量從出發(fā)菌株的12 g/L提高到59 g/L，葡萄糖轉換率達到42%。

絲狀真菌作為“微生物工廠”，因其天然優(yōu)勢常被用于大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)酶、有機酸和抗生素等物質。20世紀60年代，黃曲霉被發(fā)現(xiàn)可以用于合成L-蘋果酸，并且產(chǎn)量達到58.4 g/L[7]。Battat等[12]將L-蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量提高到113 g/L，產(chǎn)率約為0.59 g/(L·h)。盡管黃曲霉在生產(chǎn)L-蘋果酸上有巨大產(chǎn)量優(yōu)勢，但是因為其自身會合成致癌物質黃曲霉毒素，所以無法滿足食品行業(yè)的要求[13-14]。于是被認為是安全生產(chǎn)菌株[15]的黑曲霉和米曲霉受到關注。Knuf等[16]發(fā)現(xiàn)，野生型米曲霉NRRL 3485和NRRL 3488在正常情況下的L-蘋果酸合成產(chǎn)量分別能夠達到23.1和38.8 g/L，野生型米曲霉DSM1863的L-蘋果酸合成產(chǎn)量能夠達到43.47 g/L[17]。黑曲霉ATCC 9029、ATCC 9142和ATCC 10577同樣具有L-蘋果酸合成能力[18]。除了曲霉屬外，青霉屬的草酸青霉[19]、葡萄青霉[20-21]和菌核青霉[22]等也被發(fā)現(xiàn)可以用于L-蘋果酸生產(chǎn)。

與其他種類的微生物相比，曲霉屬微生物在 L-蘋果酸合成能力方面優(yōu)勢更大，而且曲霉屬微生物的基因序列注釋完整，轉化和基因敲除方法、誘變方法、高通量篩選方法成熟，有較好的底物適應性和pH適應性[23-24]。同時，它自身能夠表達水解生物質的酶，實現(xiàn)木質纖維素等廉價生物質資源的高值化轉化[25]。此外，工業(yè)上已經(jīng)實現(xiàn)了使用曲霉類微生物生產(chǎn)檸檬酸、α-淀粉酶的工藝開發(fā)，這為開發(fā)微生物產(chǎn)L-蘋果酸工藝奠定了基礎。

1.3 L-蘋果酸合成代謝途徑

分析L-蘋果酸的合成代謝途徑，為微生物發(fā)酵菌種的選擇和合成代謝途徑的改造提供了理論指導。L-蘋果酸合成代謝途徑主要有4條(圖1)。途徑1：草酰乙酸還原途徑。真菌中丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下轉化為草酰乙酸。細菌中磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下轉化為草酰乙酸，隨后草酰乙酸經(jīng)蘋果酸脫氫酶作用還原為L-蘋果酸。該途徑中生成草酰乙酸時會固定CO2[26]，所以每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量是2 mol。同時這條途徑還實現(xiàn)了能量ATP的守恒。途徑2：三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))途徑。草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸后進入TCA循環(huán)氧化生成L-蘋果酸。由于在該途徑中會有CO2釋放，所以通過這條途徑每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量為1 mol。途徑3：乙醛酸環(huán)形途徑。異檸檬酸在異檸檬酸裂解酶作用下生成乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和乙酰CoA在蘋果酸合酶作用下生成L-蘋果酸。由于需要丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，所以這條途徑每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量為1 mol。途徑4：涉及乙醛酸環(huán)形途徑酶的非環(huán)形途徑，此途徑需通過丙酮酸的轉化來補充草酰乙酸，所以每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸最大理論產(chǎn)量為1.33 mol。

Glu—葡萄糖；G-6-P—6-磷酸葡萄糖；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸；PA—丙酮酸；OAA—草酰乙酸；MA—L-蘋果酸；Acetyl-CoA—乙酰CoA；CA—檸檬酸；ISA—異檸檬酸；SA—琥珀酸；FA—富馬酸；GA—乙醛酸；PEPC—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；PYC—丙酮酸羧化酶；MDH—蘋果酸脫氫酶；CS—檸檬酸合酶；ICL—異檸檬酸裂解酶；MS—蘋果酸合酶；FUM—富馬酸酶；C4T318—L-蘋果酸轉運酶；MAE1—L-蘋果酸轉運酶圖1 L-蘋果酸生物合成代謝途徑Fig.1 Biosynthesis pathways of L-malic acid

從理論產(chǎn)量和能量守恒方面考慮，途徑1最適用于L-蘋果酸的積累。在真菌、細菌中草酰乙酸的不同轉化途徑為后期L-蘋果酸合成代謝改造提供了理論指導；在途徑2中，L-蘋果酸的高濃度積累會造成琥珀酸、富馬酸等雜酸富集，不利于下游L-蘋果酸的分離純化；對于途徑3和途徑4，它們僅僅是微生物胞內(nèi)L-蘋果酸合成代謝的補充途徑。

2 微生物發(fā)酵法產(chǎn)L-蘋果酸研究策略

2.1 利用可再生資源生產(chǎn)L-蘋果酸

從依賴化石燃料轉向利用可再生資源，尤其是一些工業(yè)副產(chǎn)物，是實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的首要任務。例如，生物柴油行業(yè)主要副產(chǎn)物粗甘油在2020年達到450億L，其中甘油占比高達67%[27]。同樣，國內(nèi)生物燃料乙醇產(chǎn)能在2018年已經(jīng)達到320萬t，其生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物稀釜餾物中甘油成分占比達到17%。將粗甘油轉化為L-蘋果酸，不但有利于新能源的生產(chǎn)、減少化石燃料的使用，而且還可提高副產(chǎn)物的附屬價值[28-31]。Iyyappan等[32-33]通過適應性進化獲得的黑曲霉MTCC 281 mutant，在25 ℃條件下以未經(jīng)處理的粗甘油為底物發(fā)酵192 h，L-蘋果酸產(chǎn)量從出發(fā)菌株的70.32 g/L提高到92.64 g/L。West[18]則發(fā)現(xiàn)，黑曲霉ATCC 9142和10577可以直接利用稀釜餾物中的甘油成分生產(chǎn)L-蘋果酸，利用率超過95%。這表明來自工業(yè)的副產(chǎn)物粗甘油可以直接用于L-蘋果酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，這必將大大降低L-蘋果酸的生產(chǎn)成本。

玉米是我國第一大糧食作物，年產(chǎn)量超過2.5億t，其中玉米粒已被完全開發(fā)為淀粉、纖維飼料、蛋白飼料及玉米胚芽油等商品，但是玉米秸稈、玉米芯等木質纖維素資源豐富、利用度卻很低[34]，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的理想原料。Deng等[35]直接利用粉碎的玉米秸稈作為發(fā)酵原料，通過嗜熱單胞菌發(fā)酵5 d后，L-蘋果酸產(chǎn)量達到21.47 g/L。玉米芯可以通過酸或酶水解成微生物可以利用的五碳糖或六碳糖，為了削弱玉米芯水解期間生成的糠醛、甲酸和乙酸等副產(chǎn)物對微生物的生長毒害作用，Zou等[36]采用適應性進化的方式提高了出芽短梗霉對玉米芯水解副產(chǎn)物的耐受性，經(jīng)過9批次發(fā)酵后，L-蘋果酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達到38.6 g/L和0.40 g/(L·h)，高于第一批的27.6 g/L和0.29 g/(L·h)。

通過菌株篩選或馴化獲得可以利用粗甘油、木質纖維素等可再生資源的菌株，是實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)的第一步。在此基礎上，通過對發(fā)酵過程的優(yōu)化和對合成代謝途徑的改造，能夠再次提高L-蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

2.2 利用外部環(huán)境脅迫積累L-蘋果酸

外部環(huán)境脅迫是所有微生物積累有機酸的常見方式，而控制氮源種類可以直接影響微生物碳通量流向。對出芽短梗霉而言，酵母粉有利于生物量的積累，(NH4)2SO4有利于L-蘋果酸積累[36]；而在嗜熱單孢菌中，酵母粉和(NH4)2SO4的效果恰恰相反[37]。Knuf等[16]發(fā)現(xiàn)在米曲霉NRRL 3488的基因序列中存在類似于酵母轉錄因子Msn2/4的結合位點，在不同氮源脅迫下，基因出現(xiàn)不同程度的表達，從而決定是否將碳通量導向L-蘋果酸的合成。這表明合適的氮源有利于L-蘋果酸的積累。

2.3 改造合成代謝途徑增強L-蘋果酸的積累

增強微生物體內(nèi)原有的L-蘋果酸合成代謝途徑是提高微生物生產(chǎn)能力的直接方法。Peleg等[41]通過13C示蹤法發(fā)現(xiàn)，曲霉主要通過草酰乙酸還原途徑積累L-蘋果酸，其中關鍵步驟是丙酮酸的羧化和草酰乙酸的還原[42]。在米曲霉NRRL 3488中，Brown等[43]和Liu等[44]過量表達丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶，將兩者表達量分別提升了4.8倍和2.1倍，L-蘋果酸產(chǎn)量達到154 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了26.23%，其中L-蘋果酸產(chǎn)率達到0.94 g/(L·h)，葡萄糖對L-蘋果酸的轉化率達到最大理論值的69%。

除了增強L-蘋果酸合成代謝途徑外，構建新的合成代謝途徑同樣可以促進L-蘋果酸積累。在途徑1中，真菌和細菌的草酰乙酸來源不同。嗜熱單孢菌muC缺少丙酮酸羧化酶，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶負責將磷酸烯醇式丙酮酸轉化為草酰乙酸，于是Deng等[35,45]將谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的pyc基因引入嗜熱單孢菌muC中，獲得可以同時表達丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的工程菌株嗜熱單孢菌muC-16，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改造后的菌株L-蘋果酸產(chǎn)量達到62.76 g/L。與嗜熱單孢菌muC相反，米曲霉依靠丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸[46]，于是Liu等[44]將細菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶引入到米曲霉NRRL 3488中，構建了將磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸同時轉化為草酰乙酸的聯(lián)合途徑，解決了米曲霉NRRL 3488胞內(nèi)草酰乙酸濃度低的問題，結果發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸產(chǎn)量提高至58.5 g/L，比出發(fā)菌株提高了38.3%。

在正常情況下，蘋果酸酶只具有催化L-蘋果轉化為丙酮酸的正向催化能力，而Dong等[47]發(fā)現(xiàn)來自擬南芥的蘋果酸酶具有微弱的催化丙酮酸生成L-蘋果酸的反向催化能力，并且L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量同樣為2 mol(式(1))。

(1)

Dong等[47]對來自擬南芥的蘋果酸酶進行了定點突變，并在大腸桿菌中構建了直接催化丙酮酸生成L-蘋果酸的新途徑，L-蘋果酸的終產(chǎn)量約為3.62 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了83.7%。經(jīng)過分子手段[48]削弱胞內(nèi)L-蘋果酸向富馬酸的轉化和提高胞內(nèi)NADPH的供應后，L-蘋果酸產(chǎn)量最終達到21.65 g/L。盡管經(jīng)過改造后L-蘋果酸產(chǎn)量依然無法和曲霉類微生物相比，但是這種對酶的改造工藝和在微生物體內(nèi)重新構建新的合成代謝途徑的思路為菌株改造提供了新的改造方向(表2)。

表2 菌株合成代謝途徑改造

2.4 通過改善細胞轉運能力提高L-蘋果酸的產(chǎn)量

在微生物發(fā)酵過程中，代謝物的積累往往會引起產(chǎn)物反饋抑制。在導致代謝產(chǎn)物無法大量積累的同時還會抑制細胞生長，甚至最終導致細胞破碎死亡[49]。細胞內(nèi)L-蘋果酸的積累會抑制TCA循環(huán)、糖酵解途徑和ABC型轉運系統(tǒng)[17,44]，阻礙L-蘋果酸合成代謝的正向進行和高濃度積累。

除簡單擴散外[50]，酵母內(nèi)還存在負責L-蘋果酸分泌的二羧酸轉運蛋白MAE1[51-52]。Yang等[53]以炭曲霉ITEM 5010菌株為出發(fā)菌株考察二羧酸轉運蛋白對炭曲霉合成L-蘋果酸能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，當炭曲霉ITEM 5010胞內(nèi)二羧酸轉運蛋白表達量提高33倍時，L-蘋果酸的產(chǎn)量也從出發(fā)菌株的0.4 g/L提高到32 g/L。Liu等[44]同時在米曲霉NRRL 3488菌株中過量表達了自身和來自酵母的編碼二羧酸轉運蛋白的基因c4t318、mae1，在兩種二羧酸轉運蛋白共同作用下，L-蘋果酸產(chǎn)量提高至89.5 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了52.5%。這些結果都表明，可以通過提高生產(chǎn)菌株中二羧酸轉運蛋白的表達量，增加胞內(nèi)L-蘋果酸的胞外轉運，碳通量持續(xù)流向L-蘋果酸合成，最終實現(xiàn)L-蘋果酸的高濃度積累。

除了提高ABC型蛋白轉運能力外，還可以通過提高細胞膜通透性促進胞內(nèi)L-蘋果酸的胞外分泌來達到積累L-蘋果酸的目的。在其他微生物發(fā)酵中提高細胞膜通透性主要有兩個方法：一個是通過EDTA結合細胞外膜上彼此連接脂多糖的Ca2+和Mg2+，使脂多糖無法穩(wěn)定細胞外膜，從而提高細胞膜通透性[54]；第二個是通過在發(fā)酵液中添加Tween-80、Triton X-100等表面活性劑來抑制磷脂合成，造成細胞膜磷脂不足，導致細胞膜通透性增加[55]。

利用微生物生產(chǎn)聚L-蘋果酸，再水解成L-蘋果酸單體是這兩年新興的研究方向。首先，聚L-蘋果酸不會對細胞的代謝和生長產(chǎn)生負面影響，能夠實現(xiàn)胞內(nèi)高濃度積累。其次，水解后的L-蘋果酸純度可以達到100%，減少了雜酸分離純化的工藝操作和成本支出[56-59]。例如，F(xiàn)eng等[57]利用細胞固定化后的出芽短梗霉CCTCC M2012223進行發(fā)酵，聚L-蘋果酸產(chǎn)量約為123.7 g/L，水解后L-蘋果酸產(chǎn)量達到144.2 g/L，產(chǎn)率達到0.74 g/(L·h)。由此可見，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚L-蘋果酸再水解成為L-蘋果酸單體為工業(yè)上獲得高產(chǎn)量、高純度的L-蘋果酸提供了可能性。

3 結論與展望

隨著環(huán)境污染加重、化石燃料消耗，化學合成法和酶轉化法生產(chǎn)L-蘋果酸將逐漸被微生物發(fā)酵法替代。但是目前利用微生物發(fā)酵法產(chǎn)L-蘋果酸依然存在諸多障礙。例如：曲霉類微生物的人工載體穩(wěn)定性差、轉化率低、拷貝數(shù)低、表達水平低；發(fā)酵副產(chǎn)物中延胡索酸、富馬酸等雜酸多等。在實驗室條件下，通過篩選或適應性進化獲得利用可再生資源的菌株、改造菌株原有的合成代謝途徑等方式提高L-蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量取得了一定成效，為加快實現(xiàn)微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)L-蘋果酸提供了參考。