魏春雨，朱道洋，上官修蕾，余曉斌

(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，簡稱黑果花楸,果實較小，鮮食口感酸澀，但其含有豐富的多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)，如原花青素、花青素、白藜蘆醇、綠原酸等，是抗氧化活性最高的水果之一[1]，具有抗菌、抗炎癥[2]等作用，可用于保肝、平衡血糖、養(yǎng)心、預防和治療癌癥、治療消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病等[3-5]。

發(fā)酵果酒的質(zhì)量取決于它的生物活性成分和風味，生物活性成分的含量不僅與果實本身含量有關(guān)，還與酵母菌的代謝相關(guān)，花青素與酵母細胞和酵母代謝物相互作用直接影響花青素的含量和組成[6]；而風味特征也是果實品種、酵母菌株和釀酒技術(shù)條件3個因素之間復雜相互作用的結(jié)果[7]。釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中除將原料中的糖轉(zhuǎn)化為酒精外，還會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，包括高級醇、乙酸酯、醛、有機酸等，是發(fā)酵果酒重要的香氣成分，并能夠顯著影響發(fā)酵果酒的感官品質(zhì)[8]。目前對于黑果花楸的研究有對黑果花楸酚類物質(zhì)[1, 9]和花青素[10-11]的研究，對黑果花楸營養(yǎng)物質(zhì)提取純化[12-13]方法的研究，國內(nèi)對于采用黑果花楸釀酒方面的研究也有諸多報道，王鵬[14]對浸提型黑果腺肋花楸露酒的浸提工藝進行了研究，于聰?shù)萚15]對黑果花楸酒的澄清工藝條件進行了優(yōu)化，但在采用不同釀酒酵母進行發(fā)酵黑果花楸酒方面研究較少，因此通過不同釀酒酵母發(fā)酵黑果花楸酒，對其進行生物活性成分、抗氧化能力及香氣成分分析，選擇進行黑果花楸酒發(fā)酵最優(yōu)酵母具有重要意義。

本研究采用5株釀造葡萄酒常用的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)F15、BO213、D254、AC、EC1118發(fā)酵生產(chǎn)黑果花楸酒，并對產(chǎn)生的5種黑果花楸酒的生物活性成分含量、抗氧化能力和香氣成分及含量進行檢測分析，以便選擇最適合進行黑果花楸酒發(fā)酵的釀酒酵母，為黑果花楸酒的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：黑果腺肋花楸(產(chǎn)地吉林)。

酵母：F15、BO213、D254、AC、EC1118(均為活性干酵母，購于阿里巴巴)。

試劑：氯化鉀、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、濃鹽酸(均為分析純)，國藥滬試；Trolox標準品、原花青素B1標準品、反式白藜蘆醇標準品(均≧98%)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；熒光素鈉(分析純)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH](97%)、Folin-Ciocalteu(分析純)、沒食子酸(≧98%)，阿拉丁試劑(中國)有限公司。

1.2 儀器與設備

Synergy H4酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；紫外可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀、SB C18色譜柱，美國安捷倫科技公司；氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀，美國力可公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑果腺肋花楸酒釀造工藝及操作要點

釀造工藝：

黑果腺肋花楸果→果粒分選→破碎打漿→添加濃縮3倍葡萄汁調(diào)整糖含量→調(diào)整硫含量→添加果膠酶→接入釀酒酵母→發(fā)酵(18 ℃)→發(fā)酵結(jié)束→皮渣分離→添加偏重亞硫酸鉀，調(diào)整硫含量終止發(fā)酵→低溫澄清→黑果腺肋花楸酒

操作要點：

(1)濃縮3倍的葡萄汁與黑果腺肋花楸果漿以質(zhì)量比1∶1混合調(diào)整含糖量。

(2)酒精發(fā)酵前偏重亞硫酸鉀添加量為50 mg/L，果膠酶添加量為0.6 g/L，總糖含量為234 g/L，酵母添加量為500 mg/L。

(3)酵母活化：按酵母與水為1∶10的比例將酵母接種于含有50 g/L的糖水中，35 ℃溫和攪拌活化20 min，添加至調(diào)整后的黑果腺肋花楸果漿與濃縮葡萄汁混合液中進行發(fā)酵。

(4)使用500 mL錐形瓶進行發(fā)酵，發(fā)酵體積300 mL，每一菌種做3組平行。

(5)發(fā)酵過程中每天進行攪拌。

1.3.2 黑果花楸酒基本理化指標檢測

總糖、總酸、揮發(fā)酸、pH、酒精度的測定參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行。

1.3.3 黑果花楸酒生物活性成分檢測

黑果花楸酒總酚含量檢測采用福林酚法[16]，總花青素檢測采用pH示差法[17]，反式白藜蘆醇檢測采用高效液相色譜法[18]。

1.3.4 黑果花楸酒抗氧化能力檢測

采用總氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)方法進行檢測，參照FENG等[19]和ZHANG等[20]的方法并稍作修改。將每份25 μL用濃度為75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋的樣品溶液與150 μL 熒光素鈉(4×10-3mmol/L)溶液在96孔微量培養(yǎng)板中混合，37 ℃孵育10 min，然后迅速向每個孔中加入25 μL AAPH(153 mmol/L)，每90 s測定1次熒光強度，約91次循環(huán)。激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm，公差均為±20 nm。以PBS(空白)或Trolox標準溶液(3.125、6.25、12.5、25、50、75 μmol/L)代替樣品溶液，構(gòu)建Trolox標準衰減曲線。通過減去對應于空白的熒光衰減曲線(AUCblank)來計算對應于樣品的熒光衰減曲線(AUCsample)下的凈面積(Net AUC)，以Net AUC和標準品濃度繪制標準曲線，并計算標準曲線回歸方程，最終結(jié)果以Trolox等價表示。凈面積(Net AUC)計算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

Net AUC=AUCsample-AUCblank

(2)

1.3.5 GC-MS分析

送樣至江南大學國家重點實驗室氣質(zhì)聯(lián)用實驗室進行檢測。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019程序?qū)诠ㄩ本粕锘钚猿煞旨熬浦袚]發(fā)性化合物定量數(shù)據(jù)進行計算；使用Origin 2018進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果花楸酒基本理化指標

如表1所示，5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒酒精度在10.9%vol～12.0%vol，總糖含量均>6 g/L，按GB/T 15037—2006《葡萄酒》劃分，屬于半干型酒；總酸含量均>11 g/L，超出GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求(<8.0 g/L)，且pH值均<3.30，因此在發(fā)酵過程中需要進行降酸處理；揮發(fā)酸含量在0.35～0.51 g/L，符合國家標準(<1.2 g/L)。

表1 不同酵母發(fā)酵的黑果花楸酒基本理化指標Table 1 Basic physicochemical indexes of Aronia melanocarpa wine fermented by different yeasts

2.2 不同酵母發(fā)酵對黑果花楸酒生物活性成分含量的影響

如表2所示，酵母菌F15及D254發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒中總酚含量相對其他3種酵母發(fā)酵要高，分別為3 836.72、3 720.18 mg/L，其他酵母發(fā)酵的黑果花楸酒總酚含量在3 487.09～3 668.80 mg/L。同時，酵母菌F15及EC1118發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒總花青素含量相對其他3種酵母要高，分別為691.89和688.55 mg/L。酵母菌D254發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒反式白藜蘆醇含量最高，為1.03 mg/L，酵母菌AC次之。總體來說，酵母菌F15發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒生物活性成分較高，酵母菌BO213及EC1118發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒生物活性成分含量最低。果酒中酚類物質(zhì)含量受多種因素影響，除酒精度外，發(fā)酵過程中酵母細胞壁吸附酚類物質(zhì)、單寧與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合成不溶性的沉淀、酵母的次級代謝物丙酮酸、乙醛等與多酚類物質(zhì)反應生成大分子聚合物、微生物產(chǎn)生的酶降解多酚類物質(zhì)導致其水溶性下降產(chǎn)生沉淀等均會對酚類物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響[21]。

表2 不同酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中生物活性物質(zhì)含量 單位：mg/L

2.3 不同酵母發(fā)酵對黑果花楸酒抗氧化能力的影響

如圖1所示，5種酵母發(fā)酵生產(chǎn)的黑果花楸酒中，酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒ORAC值最高，酵母菌AC發(fā)酵的黑果花楸酒次之，酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒ORAC值最低。近年來很多實驗都證實葡萄酒具有抗氧化性，而其抗氧化性主要來源于其自身所含的酚類物質(zhì)，總酚含量越高，抗氧化性則越強[22]，花青素屬于生物類黃酮物質(zhì)，而黃酮物質(zhì)最主要的生理活性功能是自由基清除能力。研究證明，花青素是當今人類發(fā)現(xiàn)最有效的抗氧化劑，也是最強效的自由基清除劑[23]。因此，酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒抗氧化能力較高主要因為其含有較高的總酚及花青素；結(jié)合表2發(fā)現(xiàn)酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒多酚含量較酵母菌EC1118高，但其抗氧化能力卻較酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒低，推測其原因是因為酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒花青素含量較高。

a-ORAC值；b-熒光值圖1 不同酵母發(fā)酵對黑果花楸酒抗氧化能力的影響Fig.1 The effect of different yeast fermentation on the antioxidant capacity of Aronia melanocarpa wine

2.4 不同酵母發(fā)酵對黑果花楸酒香氣成分的影響

GC-MS對5種酵母發(fā)酵產(chǎn)生的黑果花楸酒中香氣化合物的檢測結(jié)果顯示(圖2)，酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒中香氣物質(zhì)數(shù)量最多，酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒次之。

圖2 不同黑果花楸酒中香氣成分的數(shù)量Fig.2 Quantity of aroma components in different Aronia melanocarpa wine

由5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中各香氣成分的含量匯總表(表3)可以看出，5種酒樣中香氣成分的種類及含量存在一定的差異。

表3 不同酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中香氣化合物的含量 單位：μg/L

酯類：酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒中酯類化合物含量最高，為7 328.24 μg/L，其次為酵母菌D254和F15，分別為6 350.85和5 396.62 μg/L，酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒中酯類化合物含量最少，為3 537.04 μg/L。

酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒中檢測出的酯類化合物種類最多，為21種。5株酵母菌發(fā)酵的黑果花楸酒中共檢測出7種乙酸酯，乙酸酯中乙酸乙酯含量最高，乙酸異戊酯含量次之。酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒中乙酸乙酯含量最高，賦予黑果花楸酒更多愉悅的果香；5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中能夠提供香蕉香氣的乙酸異戊酯含量均大于其閾值(200 μg/L)[8]，酵母F15及酵母BO213發(fā)酵的黑果花楸酒中乙酸異戊酯含量均較高，分別為1 296.37和1 372.55 μg/L。

醇類：酵母菌D254發(fā)酵的黑果花楸酒中醇類化合物含量最高，為7 374.37 μg/L。異丁醇(酒精、生青味、苦的)、異戊醇(果香、指甲油味)、苯甲醇(甜香、花香)和苯乙醇(茉莉、玫瑰花香)是黑果花楸酒中重要的醇類物質(zhì)。除酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒外，其余4株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中異戊醇均為含量最高的醇類化合物，異戊醇含量為酵母菌D254>酵母菌AC>酵母菌F15>酵母菌EC1118；異丁醇也是黑果花楸酒中含量較高的醇類化合物，其含量為酵母菌D254>酵母菌AC>酵母菌F15>酵母菌BO213，酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒中未檢測到異丁醇；苯甲醇和苯乙醇含量為酵母菌BO213>酵母菌D254>酵母菌AC>酵母菌F15>酵母菌EC1118。

酮、醛類：5株酵母菌發(fā)酵的黑果花楸中的酮類物質(zhì)含量最高的為2-戊酮，其次為2，3-戊二酮，后者可以給黑果花楸酒帶來奶油和黃油的味道，其中酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒2，3-戊二酮含量最高，為31.14 μg/L，酵母菌BO213、D254和EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒中2，3-戊二酮含量接近，在10.4～11.2 μg/L，酵母菌AC發(fā)酵的黑果花楸酒中未檢測到2，3-戊二酮。醛類物質(zhì)中苯甲醛含量最高，可以為黑果花楸酒提供苦杏仁和焦糖的味道，并且在5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中含量差異較大，其中酵母菌D254發(fā)酵的黑果花楸酒中苯甲醛含量最高，為1 644.40 μg/L，酵母菌EC1118發(fā)酵的黑果花楸酒中苯甲醛含量最低，為654.15 μg/L。

酸類：只有乙酸(醋酸味)在5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中均被檢出，其含量為酵母菌BO213>酵母菌AC>酵母菌EC1118>酵母菌F15>酵母菌D254，(E)-5-癸烯基乙酸、己酸和辛酸僅在酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒中有檢測到。乙酸是發(fā)酵酒中主要的揮發(fā)酸，可與醇反應生成有水果香的醋酸酯，但是當乙酸含量過高時，說明發(fā)酵酒被醋酸菌、乳酸菌污染，超過閾值200 mg/L時，發(fā)酵酒會帶有酸味。由于5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中酸含量均較低，因此不會給發(fā)酵酒帶來不愉悅的香氣。

其他：除酯類、醇類、酮醛類和酸類化合物外，黑果花楸酒中還含有萜烯類和酚類等化合物，萜烯類化合物雖然在黑果花楸酒中含量較低，但因其閾值較低，其對黑果花楸酒的香氣也會有很大貢獻。酵母菌D254發(fā)酵的黑果花楸酒中萜烯類物質(zhì)含量最高(128.12 μg/L)，在檢出的4種萜烯類物質(zhì)中，苯乙烯的含量最高。2，4-二叔丁基苯酚在5株酵母發(fā)酵的黑果花楸酒中均被檢出，且在酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒中的含量最高(5.39 μg/L)。

續(xù)表3

3 結(jié)論

分別采用5株釀酒酵母對黑果花楸進行發(fā)酵，得到5種黑果花楸酒，并對5種黑果花楸酒的理化指標、生物活性成分、總氧自由基清除能力和香氣成分進行分析，結(jié)果表明酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒中生物活性成分含量最高，總氧自由基清除能力也最強。通過GC-MS法在5種黑果花楸酒中共檢測到77種揮發(fā)性化合物，主要香氣成分包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁醇、異戊醇、苯甲醇和2，3-戊二酮。不同酵母菌發(fā)酵的黑果花楸酒中香氣物質(zhì)含量有所差異，酵母菌BO213發(fā)酵的黑果花楸酒酯類物質(zhì)含量最高，但醇類物質(zhì)含量最低；酵母菌D254發(fā)酵的黑果花楸酒醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)含量最高；酵母菌F15發(fā)酵的黑果花楸酒酮類物質(zhì)和酸類物質(zhì)含量最高。本研究為實踐中進行黑果花楸酒發(fā)酵時挑選滿足特定需求的酵母提供參考。