林楊，布麗根·加冷別克，孫建，譚慧林，周潔，劉少杰，王偉，顧美英*，張志東, *

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊，830091)3(阿克蘇地區(qū)食品安全檢測(cè)中心，新疆 阿克蘇，843000)4(阿克蘇地區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，新疆 阿克蘇，843000)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]，其大部分菌株在宿主腸道定植，并發(fā)揮維持腸道平衡、降低膽固醇含量、改善乳糖不耐癥及提高機(jī)體免疫力等功能[2]，被公認(rèn)為食品安全級(jí)微生物(generally recognized as safe，GRAS)，常用于酸奶、奶酪等乳制品的生產(chǎn)加工中[3]。乳酸菌的蛋白酶活性及產(chǎn)酸性能作為影響乳酸菌益生作用的重要因素，是篩選性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的主要指標(biāo)[4]。然而，傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶及乳酸含量較低，無法滿足現(xiàn)代發(fā)酵食品工業(yè)的需求，因此，需要對(duì)菌株進(jìn)行誘變育種，提高菌株的生產(chǎn)性能。

常規(guī)的育種方法有紫外線誘變、重離子束輻照、亞硝基胍誘變等，而常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma， ARTP)誘變是一種基于大氣環(huán)境溫度和射頻等離子體的新型微生物誘變育種技術(shù)[5]，與其他誘變方法相比，ARTP可在大氣壓和室溫(25～40 ℃)下高效誘導(dǎo)DNA鏈斷裂[6]，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高、突變多樣性大等特點(diǎn)。目前，它已成功應(yīng)用于許多不同微生物以改善其基因組[7]。如GAO等[8]使用ARTP誘變技術(shù)使得乳酸菌HX-3-3在發(fā)酵過程中的γ-氨基丁酸產(chǎn)量提高了25.98%；陳瑞龍[9]以植物乳桿菌-A65為研究對(duì)象，通過ARTP誘變技術(shù)使其細(xì)菌素產(chǎn)量提高了45%以上，大大提高了菌株的抑菌活性。

本研究對(duì)新疆烏魯木齊周邊牧區(qū)的4種傳統(tǒng)酸奶中進(jìn)行了乳酸菌的分離鑒定，優(yōu)選出1株蛋白酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)其進(jìn)行ARTP誘變，顯著提高了該菌的產(chǎn)酸能力，為后續(xù)進(jìn)一步選育和開發(fā)相關(guān)優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4種傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，均采集于新疆烏魯木齊南山牧區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

酪蛋白固體培養(yǎng)基[10](g/L)：酪蛋白10，牛肉膏3，NaCl 5，Na2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂18，pH 7.3±0.2，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min。

1.3 菌株的分離純化

取各酸奶樣品25 mL于225 mL無菌水中，振蕩搖勻，依次稀釋至10-6。分別取各濃度稀釋液100 μL，均勻涂布于含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) CaCO3的MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的單菌落，進(jìn)行分離純化。菌株經(jīng)重復(fù)純化3次后轉(zhuǎn)接至斜面，于4 ℃保藏備用。

1.4 菌株形態(tài)及代謝活性分析

菌株的形態(tài)特征鑒定參照東秀珠等[11]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

過氧化氫酶試驗(yàn)：滴加3%(體積分?jǐn)?shù)) H2O2于細(xì)菌培養(yǎng)物的試管中，產(chǎn)生氣泡為陽性，否則為陰性。產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn)：將菌株接種于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，觀察有無透明圈及透明圈的大小。

1.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27 F和1495 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]，條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，同時(shí)調(diào)取同源性最高的模式菌株，利用MEGA 7.0建立菌株Neighbor-joining(N-J)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株產(chǎn)酸量的測(cè)定

采用滴定法測(cè)定菌株的產(chǎn)酸能力[13]。取活化后的菌株按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，取各菌株的發(fā)酵液10 mL于50 mL蒸餾水中，滴加2～3滴1 g/L的酚酞作指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，以溶液出現(xiàn)粉紅色且30 s后不褪色為滴定終點(diǎn)，每個(gè)樣品3次平行[14]。以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作空白對(duì)照，其計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：V1為樣品消耗NaOH溶液的體積，mL；V2為空白對(duì)照消耗NaOH溶液的體積，mL；V0為稀釋液的總體積，mL；c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH的濃度，mol/L。

1.7 蛋白酶活力的測(cè)定

采用Folin-酚法[4]測(cè)定菌株的蛋白酶活力。蛋白酶活力的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：V為酶液的總體積，mL；T為酶解反應(yīng)時(shí)間，min；N為酶液的稀釋倍數(shù)；K為吸光常數(shù)。

通過對(duì)分離株產(chǎn)酸量及蛋白酶活力的測(cè)定，篩選出產(chǎn)酸量低，但蛋白酶活性高的菌株進(jìn)行ARTP誘變，以獲得高產(chǎn)酸的蛋白酶高產(chǎn)菌株。

1.8 ARTP誘變

1.8.1 菌懸液的制備

將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。菌體用生理鹽水洗滌2次后，重懸，并制成濃度為107～108的菌懸液，備用。

1.8.2 ARTP誘變

無菌條件下，取10 μL稀釋好的菌懸液，均勻涂于無菌金屬載片表面，以氦氣為工作氣體，設(shè)置電源功率120 W、射頻功率13 W、間距2 mm、氣流量10 L/min，處理時(shí)間分別為0、20、40、60、80、100 s。處理完的載片置于裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，進(jìn)行振蕩洗脫，形成新的菌懸液。對(duì)新的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，每個(gè)處理3次平行，利用公式(3)計(jì)算致死率[15]：

(3)

1.8.3 誘變菌株的篩選和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

從誘變菌中隨機(jī)挑選單菌落，點(diǎn)接到含2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上，并以原始菌作對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。通過測(cè)定并統(tǒng)計(jì)每個(gè)菌落的溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值(HC值)及該菌株的產(chǎn)酸量，篩選高產(chǎn)酸的突變菌株。

將篩選出的突變?nèi)樗峋暌?%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，以此作為1次傳代培養(yǎng)，并以每代的發(fā)酵液作為下一次傳代的種子液，連續(xù)傳代7次，測(cè)定其每一代的產(chǎn)酸能力，每代設(shè)置3個(gè)重復(fù)，從而驗(yàn)證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、MEGA 7.0、SPSS 19.0(SPSS Inc， USA)等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

通過在含有2% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行溶鈣圈和形態(tài)觀察，從4種樣品中共分離出潛在乳酸菌12株，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶檢測(cè)，所得菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，初步鑒定為疑似乳酸菌株。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過測(cè)序獲得上述菌株16S rRNA基因序列，與NCBI中相關(guān)模式菌株序列進(jìn)行比對(duì)，確定12株細(xì)菌分屬于乳植桿菌屬(Lactiplantibacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的4個(gè)種，代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 基于16S rRNA序列的代表菌株N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of isolates and close relatives

2.3 不同分離株的產(chǎn)酸量

不同分離株的產(chǎn)酸量如圖2所示，12株乳酸菌的產(chǎn)酸量在13～30 g/L，其中菌株T1的產(chǎn)酸量最高，達(dá)29.19 g/L；菌株S1、S2、S3、Y1、T2、X1、X2等7株菌的產(chǎn)酸量在19～26 g/L；其余菌株產(chǎn)酸量則較低，在13.5 g/L左右。

圖2 菌株產(chǎn)酸能力Fig.2 Acid-producing ability of isolates

2.4 蛋白酶高產(chǎn)菌的篩選

通過酪蛋白培養(yǎng)基從12株乳酸菌中篩選出透明圈直徑較大的5株菌S1、S3、Y8、X2、T1，通過測(cè)定其蛋白酶活力可知，菌株Y8的蛋白酶活力最高，達(dá)39.14 U/mL；其次為X2，為33.12 U/mL；而S1蛋白酶活力最低，僅為5.82 U/mL。因此，試驗(yàn)選取高產(chǎn)蛋白酶且產(chǎn)酸能力較弱的菌株Y8，進(jìn)行誘變選育。

圖3 菌株蛋白酶活力Fig.3 Protease activities of isolates

2.5 ARTP誘變選育乳酸菌

2.5.1 誘變時(shí)間的確定

誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響如圖4所示，隨著處理時(shí)間遞增，誘變20 s后致死率大幅度上升，至處理60 s 時(shí)致死率已經(jīng)達(dá)91.09%，處理80 s時(shí)，菌株存活率幾乎為零。一般而言，當(dāng)致死率在90%以上時(shí)，菌株產(chǎn)生高產(chǎn)突變的概率較高，且在此突變率下回復(fù)性更小。因此，考慮到突變穩(wěn)定性，最終選擇ARTP誘變處理的時(shí)間為60 s。

圖4 菌株Y8 ARTP誘變致死率Fig.4 Lethality rate of the isolate Y8 by ARTP

2.5.2 高產(chǎn)酸菌株的篩選結(jié)果

試驗(yàn)以菌株Y8作對(duì)照，其菌落的平均HC值為3.391，根據(jù)MRS-CaCO3培養(yǎng)基的溶鈣圈大小初步挑選出較對(duì)照株明顯變大及變小的菌株58株，同時(shí)將菌株重新點(diǎn)接于MRS-CaCO3培養(yǎng)基上測(cè)定其溶鈣圈直徑，進(jìn)一步得到溶鈣圈直徑較對(duì)照株有差異的突變株，并重新編號(hào)，結(jié)果見表1。試驗(yàn)將超出對(duì)照HC值40%的菌株定義為正突變菌株，否則為負(fù)突變菌株，最終得到1株HC值為5.023的高產(chǎn)酸菌株Y8-6。

表1 代表菌株的平板初篩結(jié)果Table 1 Screening of acid production ability of mutant isolates on plate

將誘變株分別通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其平均產(chǎn)酸量，如圖5所示，菌株Y8-6的產(chǎn)酸量最高，為 23.41 g/L，與初篩結(jié)果一致。

圖5 誘變株產(chǎn)酸復(fù)篩結(jié)果Fig.5 Acid production ability of mutant isolates

2.5.3 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將突變?nèi)樗峋赀B續(xù)傳代7次，測(cè)定其每一代的產(chǎn)酸能力，結(jié)果如圖6所示，正向突變株Y8-6經(jīng)7次傳代培養(yǎng)后，其平均產(chǎn)酸量依次為22.76、23.12、24.00、23.08、23.32、23.00、22.87 g/L，平均值為23.16 g/L。由此可見，突變株的酸產(chǎn)量穩(wěn)定。

圖6 菌株Y8-6連續(xù)7代產(chǎn)酸穩(wěn)定性情況Fig.6 Genetic stability test of acid production by the isolate Y8-6 for 7 successive generations

3 討論與結(jié)論

乳酸菌是目前世界公認(rèn)的食品安全級(jí)微生物，對(duì)人體健康具有積極作用。乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的乳酸，能夠降低體系pH，縮短發(fā)酵時(shí)間[16]，提高生產(chǎn)效率，節(jié)約成本，同時(shí)乳酸還能抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，有利于發(fā)酵環(huán)境的保持，且發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸是重要的呈味物質(zhì)，能夠賦予食物特殊的風(fēng)味。因此，篩選和保存高產(chǎn)酸性能的乳酸菌，將其利用于生產(chǎn)發(fā)酵，能實(shí)現(xiàn)更高的利用價(jià)值[17]。同時(shí)，乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶能夠水解食物中的蛋白質(zhì)使其生成更小的肽類或氨基酸[18-19]，而蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后生成的多肽，比原蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性更好，且經(jīng)消化道酶作用后分解為人體更易吸收的預(yù)消化狀態(tài)，有益于人體對(duì)蛋白質(zhì)、鈣、鐵離子及維生素的吸收，同時(shí)分解產(chǎn)生的多肽具有促進(jìn)微生物增長(zhǎng)、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功能[20]。此外，乳酸菌具有較強(qiáng)的黏附力，更易定植在腸道黏膜上形成屏障保護(hù)動(dòng)物腸道健康，尤其是產(chǎn)蛋白酶乳酸菌在腸道中定植后，不僅能夠發(fā)揮益生作用，而且能夠通過在機(jī)體消化道內(nèi)釋放蛋白酶而提高機(jī)體對(duì)蛋白類食物的利用率[21]。因此，高產(chǎn)蛋白酶、高產(chǎn)酸的菌株在發(fā)酵食品的質(zhì)量控制、風(fēng)味形成和營(yíng)養(yǎng)提升中發(fā)揮了重要的作用[22]。

新疆有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源，如酸馬奶、奶疙瘩、駝乳、干酪等具有獨(dú)特民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵制品，其中蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源[23]。本研究從4種新疆傳統(tǒng)酸奶中分離出12株疑似乳酸菌，經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定歸屬為德氏乳植桿菌保加利亞亞種(Lactiplantibacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜酸乳植桿菌(Lactiplantibacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和瑞士乳植桿菌(Lactiplantibacillushelveticus)。試驗(yàn)通過透明圈法和Folin-酚法進(jìn)一步篩選到5株產(chǎn)蛋白酶菌株，同時(shí)對(duì)其中1株蛋白酶活力最高而產(chǎn)酸能力較弱的德氏乳植桿菌保加利亞亞種Y8菌株進(jìn)行ARTP誘變育種。

ARTP誘變技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新穎且高效的物理誘變技術(shù)[24]，其能夠在常壓室溫下高效誘導(dǎo)DNA和寡核苷酸發(fā)生高強(qiáng)度斷裂，極大地改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的理化性質(zhì)[25]，進(jìn)而引起組織損傷，迫使細(xì)胞以較高的容錯(cuò)水平啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制，從而產(chǎn)生多種不匹配位點(diǎn)，并得到大量高突變體樣本[26]。與傳統(tǒng)誘變方法相比，其具有突變率高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、環(huán)境友好等特點(diǎn)[27]，因此，在微生物突變育種及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前，有關(guān)利用ARTP技術(shù)誘變?nèi)樗峋?，進(jìn)行高產(chǎn)酸菌株篩選研究較少。本研究初步確立了ARTP誘變?nèi)樗峋姆椒ǎ院鉃楣ぷ鳉怏w，設(shè)置電源功率120 W、射頻功率13 W、間距2 mm、氣流量10 L/min、處理時(shí)間60 s，此時(shí)致死率為91.09%，在該條件下，最終篩選獲得1株高產(chǎn)酸菌株Y8-6，其產(chǎn)酸能力較原始菌株提高了64.5%，且蛋白酶活性穩(wěn)定。

相關(guān)研究表明，ARTP誘變高效率突變的同時(shí)，其均勻覆蓋率及高突變率也可在一定程度上改變菌株的生理特性。進(jìn)一步驗(yàn)證選育菌種的突變穩(wěn)定性，開展誘變菌株代謝通路變化分析，仍有待深入研究。