索標(biāo)，常玉婷，王瑞，關(guān)鵬，艾志錄，范會(huì)平，黃忠民*

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州，450002) 3(國(guó)家速凍米面制品加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心，河南 鄭州，450002)4(速凍面米及調(diào)制食品河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州，450002)

即食食品是一類(lèi)以肉、蛋、糧食、蔬菜等為原料，根據(jù)消費(fèi)者飲食需要加工制作而成，打開(kāi)即可食用的食品[1]。然而，由于即食食品需要經(jīng)過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)，在加工、運(yùn)輸、貯藏、銷(xiāo)售[2]等環(huán)節(jié)中易受到微生物污染[3-5]，因而需要在烹飪、包裝之后再進(jìn)行嚴(yán)格的殺菌。近年來(lái)即食食品微生物超標(biāo)導(dǎo)致食物中毒的現(xiàn)象不斷發(fā)生，對(duì)人們身體健康產(chǎn)生了很大的威脅[6]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在自然界分布廣泛[7]，能夠產(chǎn)生抗性極強(qiáng)的芽孢，當(dāng)數(shù)量超過(guò)103CFU/g時(shí)即可能引起人嘔吐和腹瀉，從而對(duì)消費(fèi)者健康造成威脅[8]。成都市市售食品中蠟樣芽胞桿菌污染達(dá)17.6%[9]，在豬肉[10]等食品中也檢測(cè)出較高的蠟樣芽孢桿菌污染率[11]，其中熟肉制品污染風(fēng)險(xiǎn)較高[12]。因此，如何保證即食食品的安全性，有效殺死即食食品中的蠟樣芽孢桿菌，已成為即食食品安全控制的重要問(wèn)題。

即食食品的殺菌技術(shù)主要包括熱殺菌和非熱殺菌技術(shù)，非熱殺菌包含低溫等離子體、超高壓[13]和脈沖強(qiáng)光[14-15]等，但熱殺菌技術(shù)仍是目前最普遍和高效的殺菌方式。在食品生產(chǎn)中，高溫高壓殺菌會(huì)嚴(yán)重破壞食品的品質(zhì)，影響口感。在食品中添加抗菌劑也是食品安全控制的重要手段之一，化學(xué)抗菌劑會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用，天然抗菌劑是從植物、動(dòng)物或微生物中提取出來(lái)的天然無(wú)毒物質(zhì)[16]，其中，肉桂醛是肉桂精油的主要成分，具有香味，是綠色安全的天然抗菌劑[17-18]，對(duì)金黃色葡萄球菌[19]、大腸桿菌[20]、李斯特菌[18]等食源性致病菌都具有良好的抑制作用。王舒叆等[21]研究了肉桂醛對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)肉桂醛是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然抗菌劑，抑菌效果好于乳酸鏈球菌素。

隨著信息化的發(fā)展，預(yù)測(cè)微生物學(xué)發(fā)展迅速，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型可簡(jiǎn)單快速地預(yù)測(cè)不同環(huán)境因子下致病菌的生長(zhǎng)和失活規(guī)律，從而對(duì)食品的貨架期和殺菌效率進(jìn)行有效預(yù)測(cè)[22]。雖然目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用預(yù)測(cè)微生物模型擬合蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線的研究已有報(bào)道[23]，但有關(guān)即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活模型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以即食牛肉為載體，研究不同低強(qiáng)度熱處理?xiàng)l件下，不同濃度的肉桂醛對(duì)蠟樣芽孢桿菌熱失活動(dòng)力學(xué)的影響，建立其熱失活一級(jí)模型和二級(jí)模型，以期為即食食品安全控制技術(shù)的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

肉膏蛋白胨肉湯(luria bertani，LB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)、酵母浸粉(yeast extract，YE)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，北京路橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉(分析純)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；肉桂醛(純度99%)，吉安市國(guó)光香料廠；蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303，中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；牛肉糜、食鹽、味精,購(gòu)自鄭州當(dāng)?shù)氐碾p匯超市。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本 Tomy 公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；MX-S混合儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LHP-250智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠；移液槍(10～1 000 μL)，德國(guó) Eppendorf 公司；SCIENTZ-11無(wú)菌均質(zhì)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇醫(yī)療儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種保藏與菌懸液的制備

蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303于-80 ℃的甘油管中保藏。在無(wú)菌條件下，將貯存的蠟樣芽孢桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(TSA+0.6%YE)上，37 ℃下培養(yǎng)10 h，挑取單菌落至無(wú)菌的肉湯培養(yǎng)基(LB+0.6%YE)中，150 r/min 37 ℃搖床上培養(yǎng)10 h至指數(shù)后期(約108～109CFU/mL)。放在4 ℃冰箱備用。

1.3.2 即食牛肉的制作

新鮮牛肉糜購(gòu)自鄭州當(dāng)?shù)氐碾p匯超市，隨后立即保存在-30 ℃冰箱中，本研究選擇牛肉糜作為原材料，主要因?yàn)榕Ｈ饷涌勺鳛轭A(yù)制菜肴產(chǎn)品的主要成分，且可以與抗菌劑均勻混合，從而充分發(fā)揮其作用。使用前，將牛肉解凍，使用紗布包裹，清水清洗3次，除去肉中血水，100 g的肉糜使用1 000 mL的鹽水進(jìn)行煮制，加鹽量為5 g/L，味精為1 g/L，煮制時(shí)間為15 min。煮制結(jié)束后將肉粒撈出除去多余湯汁，盡快放入無(wú)菌自封袋中，放置無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行分裝，經(jīng)PCA檢測(cè)細(xì)菌為陰性。

1.3.3 肉桂醛的添加和蠟樣芽孢桿菌的接種

語(yǔ)文教育是任何學(xué)科教育的基礎(chǔ)，它在學(xué)生素質(zhì)培養(yǎng)中有不可估量的作用。語(yǔ)文課是工具性和人文性的統(tǒng)一，它的作用也可以從這兩個(gè)方面得到體現(xiàn)。

將煮好的牛肉糜在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行分裝，每個(gè)無(wú)菌均質(zhì)袋裝10 g左右的牛肉糜，添加肉桂醛使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.5%、1.0%[18]。將兩者充分混勻后，再每袋添加100 μL菌液，使初始菌落數(shù)約為108CFU/g，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，壓平，厚度? mm左右，袋內(nèi)盡量不要有空氣，最后密封。

1.3.4 熱處理

將準(zhǔn)備好的樣品放在預(yù)熱好的恒溫水浴鍋中進(jìn)行熱處理，水浴的溫度分別為55、60、65、70 ℃，經(jīng)過(guò)熱處理后立即放入冰水中降溫，并盡快進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)

將處理后的樣品，在無(wú)菌條件下加入90 mL的0.85%無(wú)菌生理鹽水，以11 次/s拍打5 min。取100 μL菌懸液經(jīng)梯度稀釋后，進(jìn)行涂布，每個(gè)處理3個(gè)平行，放置在37 ℃培養(yǎng)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與曲線擬合

使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行平均數(shù)、STDEV的計(jì)算和圖表的繪制。一級(jí)模型使用IPMP2013軟件進(jìn)行曲線擬合。weibull模型如公式(1)所示：

(1)

式中：t為時(shí)間，Y0為初始菌落數(shù)，CFU/g；Y(t)為在時(shí)間t時(shí)的菌數(shù)，CFU/g；D和α為圖形參數(shù)。

二級(jí)模型是建立菌落數(shù)與溫度和濃度之間的關(guān)系。t5.0是菌落數(shù)降低5 lgCFU/g所需要的時(shí)間，可以用來(lái)評(píng)價(jià)殺菌效果[18]。多項(xiàng)式模型如公式(2)所示：

lnt5.0=a+b×(eΤ+fC)+c×(eΤ+fC)2+d×(eΤ+fC)3

(2)

式中：a、b、c、d、e、f均為模型參數(shù);T為處理的溫度，℃；C為肉桂醛的濃度，%。

1.3.7 二級(jí)模型的評(píng)價(jià)

為了驗(yàn)證建立模型的可靠性，使用準(zhǔn)確度(Af)和偏差度(Bf)、均方根誤差(root mean squared error，RMSE)對(duì)預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行檢驗(yàn)分析。Af的值越接近于1，說(shuō)明準(zhǔn)確度越高；Bf越趨近于1，說(shuō)明模型的偏差度越小。RMSE表示模型的適用性，該值越接近于0，說(shuō)明模型越適用[24]。表達(dá)式如公式(3)～公式(5)所示:

(3)

(4)

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活初級(jí)模型的建立

為了研究不同溫度下肉桂醛對(duì)即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活的影響，選擇55、60、65、70 ℃這4個(gè)溫度進(jìn)行研究，使用IPMP2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如表1和圖1所示。誤差平方和(sum of squares due to error，SSE)、均方誤差(mean squared error，MSE)、RMSE和Residual stdev的值均接近于0，Af和Bf的值趨近于1，可以得出weibull模型對(duì)即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱失活曲線擬合效果好，準(zhǔn)確度較高，能更好的預(yù)測(cè)蠟樣芽孢桿菌的熱失活規(guī)律。PEREIRA等[25]采用weibull模型對(duì)可可豆中蠟樣芽孢桿菌孢子的熱失活曲線進(jìn)行了擬合，結(jié)果也表明該模型擬合效果較好。

表1 使用weibull模型模擬即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的 熱失活參數(shù)及菌落數(shù)降低5 lgCFU/g所需要的時(shí)間Table 1 Use the weibull model to simulate the heat inactivation parameters of B.cereus in ready-to-eat beef and the time required to reduce the number of colonies by 5 lgCFU/g

當(dāng)肉桂醛濃度相同時(shí)，溫度越高，蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)降低5 lgCFU/g所需要的時(shí)間越短。添加1%的肉桂醛與不添加肉桂醛的樣品相比，蠟樣芽孢桿菌的t5.0在55、60、65、70 ℃下分別減少了17、8.71、2.83、1.4 min。同時(shí)，在相同溫度下，肉桂醛的濃度越高，t5.0也逐漸減小，菌落數(shù)的降低速度越快，說(shuō)明肉桂醛的使用降低了即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱抵抗能力。

a-55℃；b-60℃；c-65℃；d-70℃圖1 不同溫度下添加肉桂醛的即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱失活weibull模型擬合曲線圖Fig.1 Weibull model fitting curve of thermal inactivation of B.cereus in ready-to-eat beef with cinnamaldehyde at different temperatures

2.2 二級(jí)模型的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究采用多項(xiàng)式方程擬合了蠟樣芽孢桿菌的熱失活二級(jí)模型，擬合曲線如圖2所示。采用該多項(xiàng)式二級(jí)模型，也成功擬合了溫度和抗菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律[26]。將一級(jí)模型擬合所得到的參數(shù)帶入公式(2)中，得到二級(jí)模型的擬合公式： lnt5.0=-50.748+43.562×(0.058T+0.333C)-11.805×(0.058T+0.333C)2+1.026×(0.058T+0.333C)3。

天然抗菌劑肉桂醛主要通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使內(nèi)溶物流出導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]。由圖2可知肉桂醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，lnt5.0逐漸下降，不同溫度之間下降趨勢(shì)較為一致；隨著溫度的升高，lnt5.0呈現(xiàn)階梯式下降，溫度越高，lnt5.0的值越小，蠟樣芽孢桿菌的下降速率越快。本研究結(jié)果說(shuō)明肉桂醛能明顯降低即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱抗性，提高殺菌效果。

2.3 二級(jí)模型的評(píng)價(jià)

通過(guò)計(jì)算RMSE、R2、Af和Bf判斷二級(jí)模型的擬合結(jié)果(表2)，R2、Af、Bf均接近于1，RMSE的值趨近于0，說(shuō)明多項(xiàng)式方程擬合二級(jí)模型擬合的準(zhǔn)確度較高，偏差度較小[28]。由圖3可知，殘差值呈正態(tài)分布的關(guān)系，說(shuō)明多項(xiàng)式模型的擬合結(jié)果可靠，能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)一定溫度和肉桂醛條件下即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱殺菌動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

a-肉桂醛濃度；b-溫度圖2 溫度和肉桂醛濃度與lnt5.0的二級(jí)模型擬合圖Fig.2 Fitting diagram of temperature and cinnamaldehyde concentration with lnt5.0 secondary model

表2 多項(xiàng)式模型的擬合結(jié)果Table 2 Fitting results of polynomial models

圖3 殘差分布的驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Validation results for residual distribution

3 結(jié)論

本研究分析了天然抗菌劑肉桂醛與熱殺菌技術(shù)結(jié)合對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制效果，結(jié)果表明肉桂醛的使用降低了蠟樣芽孢桿菌對(duì)溫度的抵抗能力，能夠降低即食食品的熱殺菌強(qiáng)度，減少對(duì)食品品質(zhì)的影響。并使用weibull和多項(xiàng)式方程分別建立一級(jí)和二級(jí)模型，并通過(guò)參數(shù)RMSE、R2、Af、Bf以及殘差分布圖評(píng)價(jià)模型擬合效果，所建立的低強(qiáng)度熱殺菌模型，可為即食食品安全控制技術(shù)的建立提供參考。