尹霞，陳斌，王燕清，徐朋，陳渺麗，徐慧娟，呂林艷，顧玲玲（麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，廣東珠海 519000）

阿立哌唑（aripiprazole）是由日本大冢（Otsuka）公司與美國百時美施貴寶（Bristo-Myeres Squibb）公司共同研發(fā)的首個第三代非典型抗精神病藥物，并于2002年11月15日經(jīng)美國FDA批準上市，其化學(xué)名為7-{4-[4-（2，3-二氯苯基）-1-哌嗪基]丁氧基}-3，4-二氫氯喹酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。阿立哌唑主要通過對多巴胺D2受體和血清素5-HT1A受體的部分激活，對5-HT2A受體的全部拮抗活性起效，臨床主要用于治療各種精神分裂癥和情感障礙[1-4]。目前已經(jīng)有關(guān)于阿立哌唑的有關(guān)物質(zhì)測定的文獻報道[5-8]，且阿立哌唑的質(zhì)量標準《中國藥典》、美國藥典和英國藥典均有收載，但存在一些不足，比如未考慮到各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)是否有差異而籠統(tǒng)地采用主成分自身對照法控制各雜質(zhì)的含量、流動相中采用高達25%的四氫呋喃（長期使用會腐蝕液相系統(tǒng)，降低色譜柱壽命）、流動相采用離子對試劑（延長平衡時間且降低柱壽命）、供試品溶液濃度較低靈敏度不夠而導(dǎo)致雜質(zhì)漏檢、被檢測雜質(zhì)種類較少而影響產(chǎn)品質(zhì)量的可控性和安全性、個別雜質(zhì)在色譜柱上保留過強不出峰而漏檢等。根據(jù)阿立哌唑的化學(xué)性質(zhì)、合成路線及可能的降解途徑，并通過強制降解試驗考察，本研究以乙腈-0.05%三氟乙酸作為流動相，建立了同時測定阿立哌唑中7個雜質(zhì)（A～G）的反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法，并對特定雜質(zhì)（E、F、G）進行校正因子研究。各已知雜質(zhì)以及各破壞條件下產(chǎn)生的未知雜質(zhì)在此條件下均能達到有效分離，可用于阿立哌唑的質(zhì)量控制。

圖1 阿立哌唑（a）及雜質(zhì)A（b）、B（c）、C（d）、D（e）、E（f）、F（g）和G（h）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of aripiprazole（a）and impurity A（b），B（c），C（d），D（e），E（f），F(xiàn)（g），and G（h）

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備DAD檢測器（安捷倫科技有限公司）；Water 2697高效液相色譜儀，配備UV檢測器（沃特世科技有限公司）；梅特勒-托利多XS105微量天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；KQ-400DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿立哌唑（批號：AP20716001、AP20716002、AP20818001，Neuland Laboratories Limited）；阿立哌唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00776-201302，含量：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；雜質(zhì)F（批號：ID 0042M2、ID 003LM7，含量：100%，EP）；雜質(zhì)G（批號：1805-073A6，含量：99.2%，TLC）；雜質(zhì)A、B、C、D、E（批號分別為160504、160326、140527、140526、160415，含量分別為99.1%、98.3%、99.0%、98.6%、99.0%，Molcan Corporation）；乙腈、三氟乙酸為色譜純；過氧化氫、鹽酸、氫氧化鈉為市售分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.05%三氟乙酸（10∶90，V/V）為流動相A，以乙腈-0.05%三氟乙酸（90∶10，V/V）為流動相B；流速為1.2 mL·min－1；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL；按表1的程序進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 精密稱取本品約15 mg，置于50 mL量瓶中，加15 mL乙腈，超聲使溶解，再加稀釋劑（0.05%三氟乙酸）定容至刻度，作為供試品溶液。

2.2.2 自身對照溶液 精密量取供試品溶液0.5 mL，置已加入15 mL乙腈的50 mL量瓶中，用稀釋劑定容至刻度，作為對照溶液。

2.2.3 空白溶液 以乙腈-稀釋劑＝3∶7作為空白溶液。

2.2.4 混合雜質(zhì)對照品儲備液 取7個已知雜質(zhì)對照品各約3 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈適量超聲使溶解，再加稀釋劑定容至刻度，得到質(zhì)量濃度約為60 μg·mL－1的單個雜質(zhì)對照品溶液。精密吸取上述溶液各2.5 mL，置同一50 mL量瓶，加稀釋劑定容至刻度，即得混合雜質(zhì)對照品儲備液。

2.2.5 阿立哌唑?qū)φ掌穬湟?取阿立哌唑?qū)φ掌芳s30 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入乙腈適量，超聲使溶解，再加稀釋劑定容至刻度，得到質(zhì)量濃度約為3 mg·mL－1的阿立哌唑?qū)φ掌穬湟骸?/p>

2.2.6 混合對照品溶液 精密量取上述混合雜質(zhì)對照品儲備液和阿立哌唑?qū)φ掌穬湟焊? mL，置10 mL量瓶，加稀釋劑定容至刻度，即得。

2.2.7 系統(tǒng)適用性溶液 分別取阿立哌唑原料、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F對照品適量，加乙腈適量超聲使溶解，再加稀釋劑配制成含阿立哌唑0.3 mg·mL－1、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F各約1 μg·mL－1的混合液，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取“2.2”項下空白溶液和混合對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖2，可知各雜質(zhì)分離良好且阿立哌唑與雜質(zhì)E、雜質(zhì)F的分離度均大于2.0。

圖2 阿立哌唑與7種雜質(zhì)分離試驗色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of aripiprazole and seven impurities

2.3.2 強制降解試驗 取阿立哌唑約150 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈15 mL超聲使溶解，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為供試品儲備液。

① 未破壞試驗：精密吸取上述供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加乙腈3 mL，用稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為未破壞溶液。

② 熱破壞試驗：取在高溫80℃條件下放置2 d的樣品約15 mg，精密稱定，按“2.2.1”項下方法處理，作為固體熱破壞溶液。精密吸取供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，于80℃條件下放置24 h，冷卻至室溫，加入3 mL乙腈，再加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為液體熱破壞溶液。

③ 酸破壞試驗：精密吸取供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加1 mol·L－1鹽酸1 mL，于80℃條件下放置24 h，冷卻至室溫，加1 mol·L－1氫氧化鈉1 mL中和，加入3 mL乙腈，再加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液。

④ 堿破壞試驗：精密吸取供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加1 mol·L－1氫氧化鈉1 mL，于80℃條件下放置24 h，冷卻至室溫，加1 mol·L－1鹽酸1 mL中和，加入3 mL乙腈，再加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液。

⑤ 光破壞試驗：取在（4500±500）Lx照度下放置約4 d并用紫外燈以輻照度90 uw/cm2輻照20 min的樣品約15 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入15 mL乙腈，超聲使溶解，再加稀釋劑溶解并定容至刻度，搖勻，作為固體光破壞溶液。精密吸取供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，于（4500±500）Lx照度下放置48 h并用紫外燈以輻照度90 uw/cm2輻照20 min，加入乙腈3 mL，再加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為液體光破壞溶液。

⑥ 氧化破壞試驗：精密吸取供試品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加30%雙氧水0.2 mL，80℃水浴10 min，加入3 mL乙腈，再加稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液。

取稀釋劑按上述破壞條件同法操作，作為各破壞試驗的空白溶液。

取上述各溶液，照“2.1”項下色譜條件進樣檢測，結(jié)果見圖3和表2，可知本品在光照和加熱條件下穩(wěn)定，無明顯新增雜質(zhì)產(chǎn)生，酸堿破壞下產(chǎn)生極少量雜質(zhì)A和相對保留時間為0.37和0.43的未知雜質(zhì)，在氧化破壞下不穩(wěn)定，產(chǎn)生雜質(zhì)F（5.04%），各破壞下產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與主成分峰均得到良好分離，主峰純度合格，物料守恒。

圖3 阿立哌唑強制降解疊加色譜圖Fig 3 Overlying HPLC of forced degradation test for aripiprazole

表2 強制降解試驗結(jié)果Tab 2 Forced degradation test

2.4 線性關(guān)系考察

取阿立哌唑、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F和雜質(zhì)G對照品各約6 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入30 mL乙腈，超聲使溶解，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，得到各組分質(zhì)量濃度約為60μg·mL－1的溶液，作為混合對照品儲備液。精密吸取上述儲備液適量，配制成一系列濃度水平的線性溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度C對峰面積A作圖，求得線性方程，計算回歸系數(shù)（r）。

2.5 校正因子的測定

按“2.4”項下方法配制一系列濃度水平的線性溶液，分別采用兩臺不同廠家的液相色譜儀測定，按F＝k主/k雜計算出各雜質(zhì)的校正因子，結(jié)果見表3，可知各組分的r均大于0.998，雜質(zhì)E、F和G的校正因子分別為1.33、1.06和0.90，故需采用加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)E的含量。

表3 特定雜質(zhì)校正因子測定結(jié)果Tab 3 Correction factor for specific impurity

2.6 靈敏度試驗

配制一定濃度的阿立哌唑和雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G對照品溶液進樣檢查，分別以信噪比為3∶1時溶液的質(zhì)量濃度為檢測限；以信噪比為10∶1時溶液的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果阿立哌唑和雜質(zhì)A～G的檢測限分別為0.039、0.010、0.039、0.037、0.036、0.039、0039和0.037μg·mL－1，定量限分別為0.078、0.019、0.077、0.074、0.073、0.077、0.078和0.074 μg·mL－1，可滿足靈敏度要求。

2.7 重復(fù)性和精密度試驗

精密稱取阿立哌唑約15 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈3 mL使溶解，再加稀釋劑定容至刻度，作為供試品儲備液。精密吸取上述供試品儲備液2 mL和“2.2.4”項下混合雜質(zhì)對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加稀釋劑定容至刻度，即得重復(fù)性試驗用供試品溶液，平行配制6份。精密吸取上述供試品溶液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加乙腈15 mL，再加稀釋劑定容至刻度，即得自身對照溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果6份平行樣品雜質(zhì)A～G的含量（約0.1%）的RSD分別為2.2%、2.3%、2.9%、2.4%、3.1%、2.7%和2.7%，總雜RSD為2.2%，符合規(guī)定。由另一位實驗員于不同時間采用不同儀器進行有關(guān)物質(zhì)的重復(fù)性試驗，兩位實驗人員測定雜質(zhì)A～G的含量平均值分別為0.14%、0.07%、0.09%、0.13%、0.13%、0.09%和0.10%，RSD分別為2.7%、2.6%、3.1%、3.1%、3.5%、4.5%和4.6%，總雜平均值為0.75%，RSD為3.1%，且放置過程中未產(chǎn)生大于報告限的新雜質(zhì)，表明不同人員在不同時間采用不同儀器操作中間精密度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液和自身對照溶液在不同時間進樣，結(jié)果供試品溶液在室溫條件下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，雜質(zhì)A～G的含量平均值分別為0.14%、0.07%、0.09%、0.13%、0.14%、0.09%和0.10%，RSD分別為0.5%、2.1%、1.4%、0.6%、4.6%、1.6%和2.4%；總雜平均值為0.77%，RSD為1.0%，且放置過程中未產(chǎn)生大于報告限（0.03%）的新雜質(zhì)。

2.9 準確度試驗

精密吸取“2.2”項下的混合對照品儲備液5 mL，置50 mL量瓶，加稀釋劑定容至刻度，作為回收率測定用混合對照品儲備液。精密稱取阿立哌唑（批號為AP20716001）約15 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑適量使溶解，平行配制9份，再分別加入回收率測定用混合對照品儲備液2、2.5、3 mL，加稀釋劑定容至刻度，配制成80%、100%和120%三個濃度供試品溶液，每個濃度平行配制3份，搖勻，作為供試品溶液。分別精密吸取上述9份供試品溶液0.5 mL置50 mL量瓶，加乙腈15 mL，再加稀釋劑定容至刻度，即得對應(yīng)的對照溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果雜質(zhì)E、F和G在80%濃度水平下的平均回收率分別為99.0%、94.0%和95.0%，RSD分別為2.2%、0.70%和5.1%；在100%濃度水平下的平均回收率分別為99.0%、95.0%和91.0%，RSD分別為1.7%、1.7%和0.50%；在120%濃度水平下的平均回收率分別為100.0%、96.0%和90.0%，RSD分別為1.1%、0.60%和0.30%均符合藥典規(guī)定。

2.10 耐用性試驗

為評估色譜條件的微小變動對測定結(jié)果的影響，分別考察不同品牌色譜柱、流速±0.1 mL·min－1、柱溫變化±2℃、三氟乙酸含量變化±0.01%和梯度中有機相比例變化1%對阿立哌唑與已知雜質(zhì)的分離度結(jié)果及樣品檢測結(jié)果的影響，取供試品溶液和對照溶液進樣檢測，結(jié)果阿立哌唑與雜質(zhì)分離度均大于1.5，各條件下主要單個雜質(zhì)和總雜的RSD均在0.7%～7.5%，并且不同條件下沒有大于報告限的新雜質(zhì)峰產(chǎn)生，表明此方法耐用性良好。

2.11 有關(guān)物質(zhì)的檢測

按“2.2”項下方法配制供試品溶液、自身對照溶液和空白溶液，照“2.1”項下色譜條件對阿立哌唑進行有關(guān)物質(zhì)測定，并計算各雜質(zhì)的含量，結(jié)果多批樣品的單個雜質(zhì)均小于0.10%，總雜質(zhì)均小于0.50%，多批樣品的有關(guān)物質(zhì)均符合規(guī)定。具體結(jié)果見表4。

表4 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(%)Tab 4 Determination of related impurities for aripiprazole (%)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

分別取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、阿立哌唑?qū)φ掌啡芤涸诙O管陣列檢測器下檢測，結(jié)果除雜質(zhì)E以外，其余已知雜質(zhì)和阿立哌唑均在254 nm波長附近有最大吸收。由于雜質(zhì)E與主成分阿立哌唑響應(yīng)值存在較大差異，因此本文采用254 nm作為檢測波長，計算雜質(zhì)E含量時需采用雜質(zhì)外標法或加校正因子的主成分自身對照法。

3.2 色譜條件的選擇

參考各國藥典阿立哌唑原料和制劑的質(zhì)量標準可知《中國藥典》2015年版-阿立哌唑原料（口崩片、片、膠囊）和USP40阿立哌唑口崩片有關(guān)物質(zhì)項下均采用枸櫞酸鹽-乙腈體系以等度洗脫的方式控制有關(guān)物質(zhì)，USP40阿立哌唑口崩片有關(guān)物質(zhì)項下采用0.05%三氟乙酸-乙腈體系以梯度洗脫的方式控制有關(guān)物質(zhì)，而USP40和EP8.0阿立哌唑有關(guān)物質(zhì)項下采用與USP40阿立哌唑口崩片有關(guān)物質(zhì)項下相同的流動體系，并大大縮短分析時間，由60 min縮短為35 min。本文分別采用枸櫞酸鹽-乙腈體系和0.05%三氟乙酸-乙腈體系進行初步篩選，考察其對各已知雜質(zhì)的分離情況，結(jié)果枸櫞酸鹽-乙腈體系雜質(zhì)G在色譜柱上保留過強，40 min內(nèi)還未出峰；采用0.05%三氟乙酸-乙腈體系，各雜質(zhì)與主成分均分離良好，且阿立哌唑峰形較好，故初步確定流動體系為0.05%三氟乙酸-乙腈。本研究在此基礎(chǔ)上提高供試品溶液濃度使靈敏度達到要求而避免雜質(zhì)漏檢，并進一步優(yōu)化梯度洗脫程序使阿立哌唑和雜質(zhì)F達到基線分離。

3.3 校正因子的研究

本研究首次采用不同品牌的儀器（Agilent和Waters）通過斜率法建立阿立哌唑各特定雜質(zhì)的校正因子，達到試驗更簡便快捷并降低檢驗成本的目的，結(jié)果雜質(zhì)F和G的校正因子在0.9～1.1，雜質(zhì)E的校正因子為1.33，超出了0.9～1.1的范圍，故采用加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)E的含量。

3.4 雜質(zhì)分析

根據(jù)阿立哌唑的合成工藝，可知阿立哌唑中可能存在的工藝雜質(zhì)為A～G，根據(jù)強制降解試驗結(jié)果可知雜質(zhì)A、E、F同時也是降解雜質(zhì)，在堿破壞條件下產(chǎn)生雜質(zhì)A，酸破壞下雜質(zhì)E增大及氧化破壞下極易產(chǎn)生雜質(zhì)F，提示本品應(yīng)該密封保存。

多批樣品中均只檢測出已知雜質(zhì)E和雜質(zhì)G，相對保留時間為1.23的未知最大單雜，且以上各雜質(zhì)含量均小于0.10%。雜質(zhì)E為阿立哌唑脫氫化物，在酸性條件下容易生成，提示在阿立哌唑制劑的生產(chǎn)過程中應(yīng)特別注意pH環(huán)境，避免pH過低。

綜上所述，本研究建立了一種有效監(jiān)測阿立哌唑中有關(guān)物質(zhì)的RP-HPLC法，并對該方法的有效性和檢出能力進行了全面的評價。結(jié)果該方法準確度高、專屬性強、耐用性好，可以同時控制阿立哌唑中的7個雜質(zhì)，為阿立哌唑的質(zhì)量控制提供參考。