李鵬程，向雪寶，何 楠，吳振江，靳三丁△

（1鄭州大學附屬兒童醫(yī)院燒傷整形科，河南鄭州450000；2廣西醫(yī)科大學基因組學與個體化醫(yī)學研究中心，廣西南寧530000；3鄭州大學附屬兒童醫(yī)院病理科，河南鄭州450000；4河南省胸科醫(yī)院胸外科，河南鄭州450000）

病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，是臨床中最常見的真皮纖維增生性疾病，典型的病理特征為成纖維細胞異常增殖及膠原蛋白過度沉積等，尤以瘢痕疙瘩為著，其可伴有瘙癢、疼痛、瘢痕攣縮致功能障礙，甚至反復破潰而引起惡變等，嚴重影響患者生活質量，應采取積極治療措施［1］。目前常用的治療方法有局部用藥、壓迫治療、激光、手術及放射治療等，但尚未找到單一滿意療效的方法，綜合治療仍為臨床首選。又因病理性瘢痕與人種、遺傳因素、血型和膚色等關系密切，提示基因治療具有重要意義。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migra‐tion inhibitory factor，MIF）屬多功能細胞因子，具有促炎、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞增殖、轉移和促組織纖維化等多種功效［2］，在病理性瘢痕中表達升高，可以促進成纖維細胞增殖等，進而加重疾?。?］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated pro‐tein kinase，MAPK）通路在畸變中發(fā)揮核心作用，通過影響細胞凋亡實現(xiàn)對腫瘤的調(diào)控［4］；轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）與病理性瘢痕關系密切，影響細胞的增殖、分化及凋亡，可介導Sma和Mad相關蛋白（Sma-and Mad-related pro‐teins，Smads）家族，調(diào)控靶基因發(fā)揮作用［5］。在病理性瘢痕中黏結蛋白聚糖1（syndecan-1）可以通過調(diào)控ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路發(fā)揮作用［6］。而MIF是否通過ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路影響病理性瘢痕，目前尚不清楚。因此，本研究收集瘢痕疙瘩樣本并提取成纖維細胞，過表達/干擾MIF后觀察其對成纖維細胞生物學行為的影響，探討其相關機制，以期為病理性瘢痕的基因治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 收集鄭州大學附屬兒童醫(yī)院燒傷整形科與河南省胸科醫(yī)院胸外科手術切除的瘢痕疙瘩組織，同時收集正常皮膚組織（來源于同一患者的正常皮膚組織），共6例，其中男2例，女4例，年齡18～29歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并批準。樣本收集前患者或監(jiān)護人均知情和同意該研究，并簽署知情同意書。

瘢痕疙瘩診斷標準：（1）腫塊隆起于皮膚表面，堅硬，表面光滑發(fā)亮，界限欠規(guī)則，1年內(nèi)無退宿跡象；（2）病變超過原始損傷邊緣，向周圍正常組織發(fā)生浸潤，蟹足狀生長；（3）具有持續(xù)性生長、發(fā)紅、疼痛、瘙癢等癥狀；（4）病理學檢查證實瘢痕疙瘩組織內(nèi)有膠原及基質成分的大量沉積，成纖維細胞增多，并有分裂相。納入標準：（1）符合上述瘢痕疙瘩診斷標準；（2）未使用瘢痕抑制藥物；（3）局部未行除常規(guī)切除術以外的其他治療。排除標準：（1）伴有其他嚴重疾病者；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）病灶處存在嚴重的潰瘍、感染等皮膚外觀異常者。

1.2 試劑與儀器 LipofectamineTM2000、p-EGFPN1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIFsiRNA均購自廣州銳博生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；MTT試劑盒及抗MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、p38 MAPK和磷酸化p-p38 MAPK（phosphory‐lated p38 MAPK，p-p38 MAPK）抗體（Abcam）。CO2培養(yǎng)箱（北京金洋萬達科技有限公司，型號CJ25-200L）；實 時 熒 光 定 量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀（ABI，型號7500）；流式細胞儀（Thermo Fisher Scientific，型號CytoFLEX）；沖片機（北京京晶科技有限公司，型號TH-25）。

2 方法

2.1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF mRNA水平的檢測 RT-qPCR引物由軟件Primer Premier 5.0設計，MIF的上游引物序列為5'-GTTCCTCTCC‐GAGCTCACC-3'、下游引物序列為5'-TGCTGTAC‐CACGCCTTCTG-3'（產(chǎn)物長度為180 bp）；GAPDH的上游引物序列為5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-GCCTGCTTCAC‐CACCTTCTTG-3'（產(chǎn)物長度為269 bp）。每組取樣5 mg，Trizol提取總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。RTqPCR儀檢測細胞中MIF mRNA水平，反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s、61℃（MIF）或60℃（GAPDH）退火45 s、72℃延伸30 s，40個循環(huán)。2?ΔΔCt法計算MIFmRNA相對表達水平。

2.2 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF蛋白水平的檢測 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織各取5 mg組織，手術剪剪碎后添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，4℃、10 000 r/min離心20 min，上清為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣量30μg，SDSPAGE，低電壓轉膜過夜，10%脫脂奶粉封閉液封閉PVDF膜1 h，添加對應I抗MIF于4℃孵育過夜。HRP標記的IgG孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化學發(fā)光后X光片曝光，沖片機沖片。圖像分析軟件分析X光膠片上蛋白條帶灰度，計算出檢測基因與內(nèi)參的比值。

2.3 樣本收集與細胞分離、培養(yǎng)瘢痕疙瘩組織 利用組織塊培養(yǎng)法從瘢痕疙瘩組織樣本中提取成纖維細胞。去除組織皮下組織，將組織切成2 mm×2 mm×2 mm左右的方塊，置于6孔板中央，樣本上方覆蓋22 mm蓋玻片，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，細胞牢牢地貼壁在培養(yǎng)皿中時，添加含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞，每天觀察細胞狀態(tài)，3 d換液1次。待細胞長成單層時，0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，細胞2～3 d更換一次培養(yǎng)液，4～5 d傳代1次，細胞傳至3代，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。本研究細胞傳代6～8代進行實驗。

2.4 細胞分組及處理 實驗分為對照（control）組、空載體組（empty vector，EV）組、MIF過表達組（MIFover-expression，MIF OE）組、陰性對照組（siRNA NC組）和MIF干擾組（si-MIF組）。細胞轉染前1 d，對成纖維細胞消化、傳代，每孔4×105個接種至6孔板中置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度>85%時，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，空載體組、MIF過表達組、陰性對照組和MIF干擾組均用li‐pofectamineTM2000分別轉染p-EGFP-N1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIFsiRNA 4μg，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中轉染6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 RT-qPCR檢測細胞中MIF的mRNA水平 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，參考2.1中方法檢測細胞中MIF的mRNA水平。

2.6 MTT實驗檢測細胞活力 以每孔1×104個接種至96孔板，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)12、24、48、72和96 h，MTT法測定490 nm處的吸光度（A），計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 每孔4×105個接種至6孔板中，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后胰蛋白酶消化處理并離心，各組細胞各取5×105個于1.5 mL EP管中，每管加入500μL結合緩沖液懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC及10μL PI混勻并室溫避光放置約20 min，然后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.8 Western blot法檢測細胞中MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白水平 每孔4×105個接種至6孔板中，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后胰蛋白酶消化細胞，細胞收集至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，添加200μL蛋白裂解液，冰上裂解細胞20 min，4℃、10 000 r/min離心20 min，上清為總蛋白，參考2.2中蛋白檢測方法檢測細胞中MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白水平。

Figure 1.The mRNA（A）and protein（B and C）levels of MIF in keloid tissue and normal skin tissue.1 to 6：each sample.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs normal skin tissue.圖1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF的mRNA和蛋白水平

3 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF的mRNA和蛋白水平情況

與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織中MIF的mRNA和蛋白水平升高（P<0.05），見圖1。

2 成纖維細胞的分離、培養(yǎng)與傳代結果

顯微鏡下觀察第3代細胞，可見細胞形態(tài)均一，長梭形、片簇狀排列，見圖2。

3 MIF轉染細胞情況的驗證結果

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞中MIF的mRNA和蛋白水平顯著升高（P<0.05），MIF干擾組細胞中MIF的mRNA和蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

4 MIF對細胞活力的影響

轉染12 h，分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞活力顯著升高（P<0.05）；處理24、48、72和96 h，分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理12 h相比，處理24、48、72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理24 h相比，處理48、72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理48 h相比，處理72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05），見圖4。

Figure 2.The morphological change of scar fibroblasts observed under microscope（scale bar=200μm）.圖2 顯微鏡下觀察瘢瘢成纖維細胞形態(tài)

Figure 3.The mRNA（A）and protein（B and C）expression of MIF in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖3 瘢瘢成纖維細胞中MIF的mRNA和蛋白表達情況

5 MIF對細胞凋亡的影響

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組的細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），MIF干擾組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），見圖5。

6 MIF對細胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白水平的影響

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞中Bax、cleaved caspase-3和Smad7的蛋白水平顯著降低（P<0.05），Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平顯著升高（P<0.05），MIF干擾組細胞中Bax、cleaved caspase-3和Smad7的蛋白水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖6～8。

討 論

Figure 4.Effects of MIF treatment for 12，24，48，72 and 96 h on the viability of the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；△P<0.05 vs siRNA NC group；a P<0.05 vs 12 h；b P<0.05 vs24 h；c P<0.05 vs48 h.圖4 MIF處理12、24、48、72和96 h對瘢瘢成纖維細胞活力的影響

Figure 5.The effect of MIF on the apoptosis of the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖5 MIF對瘢瘢成纖維細胞凋亡的影響

Figure 6.Effects of MIFon apoptosis-related proteins Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs overexp MIFgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖6 MIF對瘢瘢成纖維細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的影響

病理性瘢痕常見致病因素包括創(chuàng)傷、燒傷、手術、皮膚穿刺、疫苗接種及痤瘡等，其形成過程不僅涉及成纖維細胞異常增殖及膠原的過度沉積，還與較低的凋亡率有關。延長成纖維細胞周期、抑制生長、促進細胞凋亡、阻止成纖維細胞表型轉化等方式可減少細胞纖維化形成，成為治療病理性瘢痕的關鍵［7-8］，故本文以瘢痕成纖維細胞為研究對象。隨著研究的不斷深入，以及基因技術在臨床上的應用廣泛，基因療法可以從根本上對病理性瘢痕進行干預。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MIF的mRNA和蛋白水平在瘢痕疙瘩組織中高表達，接著過表達或沉默MIF的表達，探討其在病理性瘢痕治療中的應用價值，為臨床上病理性瘢痕的治療提供實驗依據(jù)。

Figure 7.Effects of MIF on the protein levels of TGF-β1/Smads signaling pathway-related molecules TGF-β1，Smad2，Smad3 and Smad7 in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIF OE group；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖7 MIF對瘢瘢成纖維細胞中TGF-β1/Smads通路相關蛋白TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7的影響

MIF在先天免疫防御中發(fā)揮重要作用，當外源性細菌等可刺激白細胞釋放MIF進入血液，MIF結合其他免疫細胞引發(fā)急性免疫功能［9］。在外源刺激下機體為恢復其功能，升高MIF的表達發(fā)揮免疫功能。MIF在肺纖維化中表達升高，在成纖維細胞增殖、膠原合成以及器官纖維化過程中發(fā)揮重要作用［10］；MIF通過下游多種信號通路發(fā)揮作用，MIF在病理性瘢痕中表達升高，一方面MIF能夠抑制抑癌基因P53的功能和促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，另一方面其能夠激活MAPK家族從而促進腫瘤增殖［11］。MIF過表達可通過促炎癥反應環(huán)節(jié)誘導腫瘤壞死因子α的生成，腫瘤壞死因子α能有效誘導TGF-β1表達，TGF-β1作為腫瘤促進因子，可促進腫瘤細胞無限增殖［12］。MIF通過CD74/CD44受體復合物介導ERK通路，促進ERK通路活化，ERK通路是MAPK中經(jīng)典通路，在細胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用，活化的ERK可以避免細胞凋亡，并促進細胞周期進展［13］。TGF-β1在病理性瘢痕中高表達，被認為與傷口愈合關系密切，能夠促進纖維化和瘢痕形成；作為瘢痕疙瘩的關鍵致病因子，能夠刺激纖維細胞大量增殖及膠原、彈力蛋白的合成［14］；同時與細胞凋亡關系密切，是組織損傷的上調(diào)基因，作用貫穿傷口愈合始終。Smads蛋白家族在TGF-β1超家族信號轉導中發(fā)揮作用，Smad2和Smad3屬TGF-β1受體調(diào)節(jié)型蛋白，活化的Smad2、Smad3與TGF-β1的表達趨勢類似，能夠形成低聚物與膠原啟動基因集合，調(diào)節(jié)瘢痕的形成；Smad7屬拮抗型蛋白，能夠拮抗這一過程，形成負反饋，抑制上述過程［15-16］。TGF-β1/Smads通路與細胞凋亡關系密切，參與腫瘤細胞的增殖和凋亡等過程［17］。在本研究中，過表達MIF后，細胞中Smad7蛋白水平降低，TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK蛋白水平升高，提示過表達MIF后可以激活ERK/MAPK通路，活化TGF-β1促進Smad2和Smad3的表達，抑制Smad7的表達，從而促進病理性瘢痕的形成；而干擾MIF表達后可抑制上述過程，從而降低p-ERK、pp38 MAPK、TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表達，促進Smad7的蛋白表達，實現(xiàn)對疾病的保護，為臨床上MIF抑制劑、MIF干擾劑或敲除MIF用于治療病理性瘢痕提供了可能，但具體機制有待進一步研究。

Figure 8.Effects of MIF on ERK/MAPK pathway-related proteins in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖8 MIF對瘢瘢成纖維細胞中ERK/MAPK通路相關蛋白的影響

在病理性瘢痕中，成纖維細胞過度增殖是導致瘢痕形成的主要環(huán)節(jié)，多種凋亡抑制基因以及促凋亡基因參與成纖維細胞增殖和凋亡過程，Bax和Bcl-2均作為Bcl-2家族成員，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2能夠抑制凋亡，二者相互作用影響細胞凋亡過程［18］。caspase-3作為凋亡調(diào)控因子，活化的cleaved cas‐pase-3能夠啟動激酶級聯(lián)反應，從而促進細胞凋亡［19］。在病理性瘢痕中細胞凋亡基因受到抑制，細胞調(diào)控周期變短，促進細胞增生，促進瘢痕形成［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達MIF后，細胞活力升高，凋亡率降低，細胞中促凋亡蛋白Bax和凋亡調(diào)控蛋白cas‐pase-3表達量降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達量升高，提示在病理性瘢痕中MIF處于高水平狀態(tài)，MIF通過激活ERK/MAPK通路促進TGF-β1表達，提高細胞活力，抑制細胞凋亡，參與瘢痕形成。干擾MIF后，細胞存活率降低、凋亡率升高，促凋亡蛋白表達升高，促進成纖維細胞凋亡，減少瘢痕的發(fā)生。

綜上所述，沉默MIF可抑制病理性瘢痕ERK/MAPK及TGF-β1/Smad2/3通路中相關因子的表達，進而促進細胞凋亡，抑制成纖維細胞過度生長，為臨床治療病理性瘢痕基因治療提供新的策略，相關結論有待于更大樣本的研究來進一步證實。另外，鑒于病理性瘢痕發(fā)病機制復雜，與細胞周期、細胞遷移等多種過程關系密切，發(fā)現(xiàn)更多與MIF有關的機制是接下來的研究重點。