唐 琪，蔡瑞平，薛銳澤，劉月陽，姚 陽，周明生△

（1沈陽醫(yī)學院生理教研室，2沈陽藥科大學，遼寧沈陽110034）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是引起終末期腎?。╡ndstage renal disease，ESRD）的主要病因［1-3］。相關流行病學調(diào)查結果顯示，到2030年，全球糖尿病發(fā)病率將比2010年增加近1.5倍［4］。DN表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿增加，其典型的腎形態(tài)變化包括腎小球和腎小管基底膜（glomerular basement membrance，GBM）增厚、腎小管萎縮、腎臟炎癥細胞浸潤、腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等［5-6］。DN常伴有腎血管功能障礙［7］，腎臟炎癥，氧化應激［8-9］和腎纖維化［10］增加等過程，其中氧化應激反應被認為在DN發(fā)病中起著非常重要的作用。目前，臨床上對DN的治療主要通過控制血糖以及一些對癥治療方法來延緩疾病的發(fā)展，延長患者生存時間［11-12］，尚缺乏針對DN的有效治療藥物。

生長激素釋放激素（growth hormone release hor‐mone，GHRH）是主要由下丘腦分泌的一種神經(jīng)多肽，通過促進腦垂體合成和釋放生長激素而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，對機體生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。但近年來發(fā)現(xiàn)除腦垂體和中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，機體中許多細胞也可表達GHRH受體，如心臟、血管、胰島細胞、腎臟和視網(wǎng)膜細胞等［13］。MR409是由美國邁阿密大學醫(yī)學諾貝爾獎獲得者Andrew Schally實驗室合成的一種生長激素釋放激素類似物（growth hormone releasing hormone analogue，GHRHA），目前尚未在市場銷售。與體內(nèi)天然GHRH多肽相比，MR409具有半衰期長，作用穩(wěn)定并且無下丘腦-垂體軸刺激等副作用。MR409通過促進干細胞增殖，抑制氧化應激反應等在實驗性1型糖尿病胰島移植［14］、糖尿病眼病［15］、各種心臟［16-17］和血管［18］病變等當中發(fā)揮保護作用。MR409對糖尿病腎病的影響尚無文獻報道，基于DN與糖尿病眼病均屬于微血管病變，且二者在發(fā)病機制上如炎癥和氧化應激反應等過程中具有一些相似性，因此本項工作選用MR409治療db/db轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠，探討其對小鼠腎損傷、腎纖維化及腎臟氧化應激的影響。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級雄性10周齡野生型（wild type，WT）小鼠10只，體重（27±2）g，db/db小鼠20只，體重（48±4）g，購買于南京大學動物模型研究中心。

2 主要試劑與儀器

MR409由邁阿密大學Andrew Schally實驗室合成并贈送。尿蛋白定量測試盒（CBB法）、肌酐（creati‐nine，Cr）測試盒（肌氨酸氧化酶法）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（COD-PAP法）和甘油三脂（triglyceride，TG）測定試劑盒（GPO-PAP酶法）購于南京建成生物工程研究所有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、糖原PAS染色液試劑盒、Masson三色染色試劑盒和天狼星紅染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）為Sigma-Aldrich產(chǎn)品；gp91phox抗體（Abcam）；p22phox、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）抗體均為Santa Cruz產(chǎn)品；β-actin抗體（ABclonal）；實驗中所使用Ⅱ抗（抗羊、抗兔、抗鼠）均為Proteintech產(chǎn)品。熒光酶標儀（Omega）；SDS電泳儀（Bio-Rad）。

3 方法

3.1 動物模型的建立及分組 SPF級10周齡雄性db/db小鼠和WT小鼠，適應性飼養(yǎng)2周后進行治療，治療8周后處死所有小鼠。db/db小鼠是一種先天瘦素受體基因缺失的小鼠，用于復制2型糖尿病模型，長期的高血糖可導致腎臟損傷。所有小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，光/暗循環(huán)12 h。WT小鼠為正常對照組（WT組），將db/db小鼠隨機分為模型組（db/db組）和MR409治療組（MR409-db/db組），MR409治療組隔天皮下給予MR409（每只15μg；MR409溶解于含有1‰DMSO的10%的丙二醇溶液中），對照組和模型組注射等量的溶劑對照，治療8周，治療期間每周測定體重并觀察小鼠的生長情況。MR409藥物劑量和方法是參考Zhang等［14］治療小鼠使用的劑量（每只10μg），考慮到db/db小鼠的體重大于一般小鼠體重，劑量調(diào)整為每只15μg，隔日皮下注射，該劑量經(jīng)本實驗驗證有效。

3.2 樣本收集 小鼠禁食8～10 h，用1%的戊巴比妥鈉（100 mg/kg）處死小鼠后取血，室溫放置血液凝固后1 000×g離心10 min取上清，-80℃保存；小鼠尿液由膀胱穿刺收集。取出小鼠腎臟后剔除周圍多余脂肪組織，稱量雙側(cè)腎臟濕重后去除腎臟外包膜，取小鼠左腎放入?80℃冰箱保存，用于提取蛋白進行Western blot檢測，右腎放入4%多聚甲醛保存，做成石蠟切片后行病理檢測。以腎重（g）÷體重（g）×100%作為腎臟指數(shù)（kidney index，KI）。

3.3 生化指標檢測 尿蛋白定量測試盒（CBB法），肌酐測定試劑盒（肌氨酸氧化酶法，微板法），膽固醇測定試劑盒（單試劑GPO-PAP法），甘油三酯測定試劑盒（單試劑GPO-PAP法）和血糖試紙條（葡萄糖氧化酶法）檢測各項生化指標。

3.4 腎組織形態(tài)學觀察 將4%多聚甲醛固定過的腎臟部分取出，流水沖洗，經(jīng)包埋、固定，連續(xù)切片制作成3μm厚的石蠟切片，將切片脫蠟至水，進行PAS和Masson等化學染色，中性樹膠封片，普通光學顯微鏡下觀察各組腎臟組織形態(tài)學變化。PAS染色評估腎小球損傷，腎小球中深紫色被認為是腎小球硬化，用ImageJ軟件分析腎小球硬化區(qū)域百分比。Masson和天狼星紅染色評估腎纖維化程度，Masson染色中藍色被認為是膠原纖維，天狼星紅染色中紅色被認為是膠原纖維，用ImageJ軟件評估陽性染色區(qū)域的百分比來評價腎臟組織纖維化程度。

3.5 Western blot 用組織細胞裂解液對小鼠腎臟進行裂解，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度加入適量上樣緩沖液，充分混勻后，放入恒溫干浴器中進行蛋白變性，100℃加熱10 min。上樣后經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用5%的BSA室溫封閉2 h，再分別加入Ⅰ抗［β-actin（1∶3 000），p22phox（1∶200），gp91phox（1∶1 000），TGFβ1（1∶200），F(xiàn)N（1∶200）］，搖床上室溫孵育2 h，放入4℃冰箱過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，用ECL顯影液孵育1 min，吸去膜上多余顯影液，用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，拍照后用Image J進行灰度值分析，結果用目的蛋白與β-actin的比值表示。

3.6 原位O2-的測定 3μm厚度的腎臟石蠟切片脫蠟后浸入含有2μmol/L DHE的HEPES緩沖液中，37℃避光孵育30 min。采用Leica熒光顯微鏡攝取圖片，采用雙盲設計評估圖像的氧化熒光強度，平均熒光強度用于目標定量。

4 統(tǒng)計學處理

采用Image J圖像分析軟件對染色攝取圖片以及Western blot結果進行定量分析，結果均重復3～5次。采用IBM SPSSStatistics 24進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MR409降低db/db小鼠血清中TC和TG水平并改善腎臟功能

MR409治療對db/db小鼠血糖無明顯改變。與WT小鼠相比，db/db小鼠血清中TC和TG水平顯著增加（P<0.01），MR409治療后db/db小鼠血清中TC和TG水平降低（P<0.05），見表1。與WT小鼠相比，db/db小鼠尿蛋白/肌酐比顯著升高（P<0.01），MR409治療可降低該比值（P<0.05）；小鼠糖尿病后期腎臟萎縮，腎功能下降，經(jīng)MR409治療后，db/db小鼠腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.01），見圖1。

表1 各組代謝及生化指標Table 1.Metabolic and biochemical indexes of each group（Mean±SEM.n=10）

2 MR409治療減輕db/db小鼠的腎組織結構損傷

HE染色可見，WT組小鼠腎小球，腎小管及系膜結構排列整齊，輪廓清晰，基底膜較完整。db/db組小鼠腎小球充血擴張，系膜基質(zhì)增多，腎小囊壁細胞部分萎縮。為了評估MR409的治療對db/db小鼠腎損傷的作用，將腎組織用PAS染色，腎小球中紫紅色被認為是陽性，計算出腎小球硬化面積的百分比。與WT組小鼠相比，db/db小鼠腎小球硬化程度顯著增加（P<0.01），而MR409治療可顯著改善腎小球硬化程度（P<0.01）。見圖2。

3 MR409治療降低db/db小鼠的腎臟纖維化程度

為了確定MR409對腎臟纖維化的影響，進行了Masson染色和天狼星紅染色，并對膠原纖維染色區(qū)域做定量分析。Masson染色模型組小鼠腎臟中有明顯的藍色膠原纖維，天狼星紅染色模型組小鼠腎臟中有明顯的紅色膠原纖維。Masson染色和天狼星紅染色均顯示，與WT小鼠比較，db/db小鼠腎臟間質(zhì)陽性膠原纖維顯著增加（P<0.01），MR409治療后db/db小鼠腎臟間質(zhì)陽性膠原纖維顯著降低（P<0.01），見圖3。

Figure 1.The ratio of albuminuria/creatinine（A）and kidney index（B）in each group.Mean±SEM.n=10.**P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖1 各組小鼠尿蛋白/肌酐比及腎臟指數(shù)情況

Figure 2.Morphological observation of renal tissues in each group（A）and quantitative assessment of glomerular sclerosing area（B）.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WTgroup；##P<0.01 vsdb/db group.圖2 各組腎組織的形態(tài)學觀察

4 MR409治療降低db/db小鼠腎臟組織TGFβ1和FN蛋白表達水平

與對照組相比，db/db小鼠的腎臟組織TGFβ1和FN顯著增加(P<0.05)，MR409治療后TGFβ1和FN表達均降低（P<0.05），見圖4。

5 MR409治療降低db/db小鼠腎臟的氧化應激水平

與對照組比較，db/db小鼠腎組織細胞平均氧化熒光強度顯著增加（P<0.01），MR409治療后顯著降低db/db小鼠腎組織內(nèi)平均氧化熒光強度（P<0.01），見圖5。與DHE染色平均氧化熒光強度變化相一致，在db/db小鼠腎組織中兩個NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox的蛋白表達顯著增加（P<0.05），而MR409治療后兩個NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox的蛋白表達顯著降低（P<0.05），見圖6。

討 論

糖尿病患者長期血糖失控可引發(fā)各種并發(fā)癥，其中近三分之一的1型或2型糖尿病最終可發(fā)展為DN［5］。DN是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥的腎臟表現(xiàn)，也是導致糖尿病患者終末期腎病及死亡的主要病因之一，主要表現(xiàn)為腎小管及間質(zhì)持續(xù)進展的纖維化［19］。目前對DN的治療缺乏有效的方法，特別是終末期糖尿病腎病主要依賴透析治療來延緩生命。本研究結果顯示用GHRHR激動劑MR409長期治療可以明顯減少db/db糖尿病小鼠的蛋白尿，改善腎組織的結構損傷和纖維化，并降低腎臟氧自由基和氧化應激反應，而且MR409治療對糖尿病小鼠的血糖水平無明顯影響。以上結果提示GHRHR激動劑有望成為一類新的治療糖尿病腎病的藥物。

Figure 3.Renal fibrosis in each group.Masson staining observation：blue collagen fibers are positive；Sirius red staining observa‐tion：red collagen fibers are positive.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vsdb/db group.圖3 各組小鼠腎臟纖維化情況

Figure 4.The expression levels of fibrosis-related proteins FN（A）and TGFβ1（B）in renal tissues of each group.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs WTgroup;#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖4 各組腎組織中纖維化相關蛋白表達水平

Figure 5.Reactive oxygen species in renal tissues of each group.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs db/db group.圖5 各組腎臟組織活性氧產(chǎn)生情況

Figure 6.The expression levels of oxidative stress-related proteins NADPH oxidase subunits p22phox（A）and gp91phox（B）.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WTgroup；#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖6 各組腎組織中氧化應激相關蛋白表達水平

MR409是人工合成的一個GHRHR激動劑，GHRHR是細胞膜上的一個G蛋白偶聯(lián)受體，GHRHR激動劑與受體結合后主要通過激活與G蛋白偶聯(lián)-腺苷酸環(huán)化酶-cAMP信號通路，后者進一步激活蛋白激酶A和PI3K/AKT通路發(fā)揮各種生物效應［20］。GHRHR可在下丘腦-垂體軸外的外周細胞和組織表達［13］，GHRHR激動劑可直接與這些中樞外細胞受體結合而影響這些細胞功能。在血管平滑肌細胞體外實驗中，GHRHR激動劑通過激活PKA而抑制NADPH氧化酶以及NF-κB活性，從而降低氧自由基產(chǎn)生和發(fā)揮抗炎效應［18］。研究顯示某些人工合成的GHRHR激動劑如MR409治療可以改善實驗性充血性心力衰竭的心功能和心肌結構損傷。在急性心肌梗死的小鼠模型中，MR409能促進干細胞入駐到缺血組織并修復心肌損傷［16］。GHRHR激動劑對實驗性糖尿病具有良好的治療效應，Zhang等［14］報告用GHRHR激動劑包括MR409體外預處理胰島干細胞可明顯提高胰島細胞移植的存活率和療效，降低1型糖尿病小鼠的血糖和改善胰腺功能。MR409治療能明顯改善糖尿病視網(wǎng)膜病變，其機制可能與抑制視網(wǎng)膜血管的炎癥和降低氧自由基有關［15］。GHRHR激動劑治療糖尿病腎病尚無文獻報道，本研究顯示MR409能顯著降低db/db糖尿病腎病小鼠蛋白尿和腎損傷，提示GHRHR激動劑在DN中的治療價值。盡管本研究沒有對機制進行詳細研究，我們研究結果顯示，MR409治療可顯著降低腎內(nèi)氧化應激水平，因此，降低腎臟氧化應激可能是MR409減輕糖尿病腎損傷的一個機制。

在進行性腎臟疾病中，纖維化是終末期腎衰竭的常見途徑［21］。在診斷為腎萎縮和腎衰竭的患者的腎纖維化組織中，纖連蛋白水平顯著升高［22］。FN和IV型膠原在腎小球系膜和腎小管間質(zhì)中的積累最終導致上皮向成纖維細胞過渡，從而導致纖維化，這是DN的標志性特征［23］。除FN外，TGFβ1也已被確立為腎臟纖維化的主要介質(zhì)［21，24］。TGFβ1在各種腎細胞中表達，它能調(diào)節(jié)多種途徑影響腎纖維化的進展［25-26］。TGFβ1的過表達則誘導了腎纖維化，而TGFβ1或其下游信號通路的抑制作用顯著限制了腎纖維化［26］。多項研究證明在db/db小鼠模型中，腎臟中的TGFβ1蛋白表達過量［5，27］。依帕司他可以下調(diào)db/db小鼠腎臟組織中FN、TGFβ1和III型膠原的表達，對DN具有保護作用［28］。在我們的研究中，MR409通過抑制TGFβ1和FN蛋白的表達，從而阻礙DN腎臟纖維化的發(fā)展。同時，氧化應激與TGFβ1之間存在相互聯(lián)系，TGFβ1能促進ROS的產(chǎn)生并抑制抗氧化酶，導致氧化還原失衡；反之，ROS也能激活TGFβ1［29］。NADPH氧化酶還促進炎癥細胞因子TGFβ、TNFα等的激活［30］。當ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞時，它們會引起氧化應激，從而導致組織損傷［31］。糖尿病患者的高血糖狀態(tài)通常會誘發(fā)葡萄糖代謝異常，從而產(chǎn)生大量ROS［32］。Nakayama等［33］研究中首次發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox蛋白表達的增加與db/db小鼠胰島氧化應激增加相關［33］。糖尿病引起的氧化應激可能是糖尿病大鼠腎病發(fā)生的誘因?？诜J薈可通過減少脂質(zhì)改變，減少腎臟氧化應激并提供直接的腎臟保護作用來預防糖尿病誘發(fā)的腎?。?4］。我們的研究結果顯示，db/db小鼠腎臟中NADPH氧化酶亞基p22phox和gp91phox表達增加，活性氧含量也明顯增加，MR409治療后3重指標都顯著降低。

綜上所述，GHRHR激動劑MR409對db/db小鼠糖尿病腎病具有良好的治療效應，其機制可能涉及到降低糖尿病引起腎臟氧化應激反應和抑制腎纖維化過程，其確切機制還需要進一步研究進行澄清。