易 娜，李 賀，游三麗，袁李禮△

（1長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院心內(nèi)科，2湖南省腦科醫(yī)院心內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙410007）

隨著人口老齡化的進(jìn)展，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1］，在心肌缺血、梗死和衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中均存有心肌細(xì)胞損傷［2］。氧化應(yīng)激是心肌損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一［3］，大量產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）能導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷［4］。而細(xì)胞焦亡是不同于凋亡和壞死的一種新的細(xì)胞程序性炎性死亡方式［5］，抑制焦亡能夠減輕心肌細(xì)胞損傷，減少炎癥因子產(chǎn)生并抑制炎癥反應(yīng)［6］。研究報(bào)道，過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的心肌損傷模型中存有明顯的焦亡［7］。焦亡常始于炎癥小體的形成，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS能活化NLRP3炎性小體從而參與細(xì)胞焦亡通路的激活［8］。

丹參酮ⅡA（tanshinone IIA，TAN）是傳統(tǒng)中藥丹參的脂溶性提取物，通過(guò)抗炎、抗氧化和抗凋亡等機(jī)制在多種心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用［9］，還能通過(guò)調(diào)控多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）發(fā)揮其藥理學(xué)作用。有研究報(bào)道在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，lncRNA AK003290表達(dá)降低［10］。AK003290在心臟和肌組織中高表達(dá)，能影響肌細(xì)胞的增殖分化功能［11］。丹參酮ⅡA能否通過(guò)調(diào)控AK003290影響心肌細(xì)胞焦亡尚不明確。因此，本研究構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞損傷模型，以lncRNA和細(xì)胞焦亡作為切入點(diǎn)，探討丹參酮ⅡA通過(guò)AK003290調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的影響及其機(jī)制，為丹參酮ⅡA在心血管疾病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3日齡的SPF級(jí)C57乳鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為430727201101314623，實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)為SYXK（湘）2019-0009，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合湖南省腦科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 丹參酮ⅡA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；M199培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco）；CCK-8試劑盒［東仁化學(xué)科技（上海）有限公司］；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物研究所）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒（Invitrogen）；膠原酶和BCA蛋白定量試劑盒（Sig‐ma）；小鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；兔抗小鼠GSDMD和caspase-1抗體（Cell Signaling Tech‐nology）；caspase-1活性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)方法試劑盒（Pierce）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；酶標(biāo)儀（BioTek）；熒光定量PCR儀器（Applied Biosystems）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和化學(xué)發(fā)光成像儀器（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 原代小鼠心肌細(xì)胞提取 取1～3日齡的C57乳鼠，75%乙醇消毒后處死，取出心臟并去除血塊，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，加入0.1 mmol/L膠原酶，37℃震蕩孵育1 h，細(xì)胞篩過(guò)濾后300×g離心5 min收集細(xì)胞，用含0.1 mmol/L的5-BrdU和10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基重懸后差異貼壁法收集心肌細(xì)胞，2～3 h后待成纖維細(xì)胞貼壁后輕吹培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

2.2 心肌細(xì)胞損傷模型的建立和丹參酮ⅡA處理

依照作者前期研究基礎(chǔ)［12］選用20、40和60μmol/L的丹參酮ⅡA預(yù)處理12 h，采用100μmol/L的H2O2處理12 h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型［13］。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 （1）對(duì)照（control）組、H2O2組（H2O2處理12 h）及不同濃度的丹參酮ⅡA組（20、40和60μmol/L丹參酮ⅡA預(yù)處理12 h+H2O2處理12 h）；（2）對(duì)照（control）組、H2O2組（H2O2處理12 h）、丹參酮ⅡA組（40μmol/L丹參酮ⅡA預(yù)處理12 h+H2O2處理12 h）和siAK003290+丹參酮ⅡA組（siAK003290轉(zhuǎn)染+40μmol/L丹參酮ⅡA預(yù)處理12 h+H2O2處理12 h）。

2.4 siAK003290細(xì)胞轉(zhuǎn)染和干擾序列的篩選 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成2條序列（siAK003290-1：5'-ATCTGTACTACAAACTAAAAA‐CA-3'；siAK003290-2：5'-GGAUGCAGUCACAUCU‐GUACU-3'）和1條NC-siRNA序列。siRNA用無(wú)酶水配制成20μmol/L，待細(xì)胞融合度達(dá)30～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染效率評(píng)估通過(guò)real-time PCR檢測(cè)AK003290表達(dá)來(lái)進(jìn)行，選擇效果較好的siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染12 h后進(jìn)行后續(xù)分組和實(shí)驗(yàn)處理。

2.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 細(xì)胞接種于96孔板，分組和處理同前。每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度（A）值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞抗氧化酶活性檢測(cè) 細(xì)胞接種于6孔板，分組和處理同前。收集細(xì)胞上清，依照SOD活性檢測(cè)試劑盒（羥胺法）和CAT活性檢測(cè)試劑盒（鉬酸銨法）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算樣品濃度，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.7 real-time PCR檢測(cè)AK003290表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，分組和處理同前。PBS清洗細(xì)胞，Trizol裂解液提取總RNA，再將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green方法對(duì)cDNA行熒光定量PCR擴(kuò)增AK003290及內(nèi)參照GAPDH。AK003290的正向引物序列為5'-CAAGCTCTTCCAGATATGGTG-3'，反向引物序列為5'-ACCTTTGGTATGCCTTTCCAC-3'；GAPDH的正向引物序列為5'-TGTGTCCGTCGTG‐GATCTG-3'，反向引物序列為5'-CCTGCTTCAC‐CACCTTCTTG-3'。根據(jù)2?ΔΔCt計(jì)算AK003290的相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和caspase-1表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，分組和處理同前。用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量后煮沸變性。蛋白經(jīng)12%的SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光并成像采集，以GADPH作為內(nèi)參照采用Image Lab分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18含量

細(xì)胞接種于96孔板，分組和處理同前。300×g離心5 min收集上清，依照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行圖形繪制。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹參酮ⅡA能減輕H 2O2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞損傷

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細(xì)胞活力及抗氧化酶SOD和CAT活性均顯著降低（P<0.01）；與H2O2組相比，不同濃度的丹參酮ⅡA組細(xì)胞活力及SOD和CAT活性顯著升高（P<0.05）；其中40和60μmol/L丹參酮ⅡA組的細(xì)胞活力及SOD和CAT活性顯著高于20μmol/L丹參酮ⅡA組（P<0.05），而40和60μmol/L丹參酮ⅡA組之間細(xì)胞活力及SOD和CAT活性無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the viability and antioxidant enzyme activity in H 2O2-treated primary mouse cardio‐myocytes.A：cell viability detected by CCK-8 assay；B：superoxide dismutase（SOD）activity；C：catalase（CAT）activi‐ty.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs40μmol/L TANgroup.圖1 丹參酮ⅡA對(duì)H 2O2處理的原代小鼠心肌細(xì)胞活力和抗氧化酶活性的影響

2 丹參酮ⅡA抑制H 2O2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和caspase-1表達(dá)顯著增多，細(xì)胞上清IL-1β和IL-18含量顯著增加（P<0.01）；與H2O2組相比，不同濃度丹參酮ⅡA組GSDMD和caspase-1的表達(dá)顯著減少，細(xì)胞上清IL-1β和IL-18含量顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

3 丹參酮ⅡA促進(jìn)AK 003290表達(dá)以及敲減AK003290的效果驗(yàn)證

Figure 2.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the pyroptosis of H2O2-induced primary mouse cardiomyocytes.A：GSDMD and cas‐pase-1 protein expression；B and C：IL-1βand IL-18 levels in cell supernatant.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs20μmol/L TANgroup；&P<0.05 vs40μmol/L TANgroup.圖2 丹參酮ⅡA對(duì)H 2O 2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細(xì)胞AK003290表達(dá)顯著減少（P<0.05）；與H2O2組相比，不同濃度丹參酮ⅡA組細(xì)胞AK003290表達(dá)增多（P<0.05）；且40和60μmol/L丹參酮ⅡA組的細(xì)胞AK003290表達(dá)顯著高于20μmol/L丹參酮ⅡA組（P<0.05），見(jiàn)圖3A。結(jié)合CCK-8和細(xì)胞焦亡結(jié)果，選用40μmol/L濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與si-NC相比，siAK003290-1和siAK003290-2均能降低原代小鼠心肌細(xì)胞AK003290表達(dá)（P<0.05或P<0.01），其中siAK003290-2的敲減效果更為顯著，見(jiàn)圖3B，因此選用該siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 敲減AK003290減弱丹參酮ⅡA對(duì)原代小鼠心肌細(xì)胞損傷的抑制作用

與丹參酮ⅡA組相比，siAK003290+丹參酮ⅡA組的原代小鼠心肌細(xì)胞活力及抗氧化酶SOD和CAT活性均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

5 敲減AK003290減弱丹參酮ⅡA對(duì)原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡的抑制作用

與丹參酮ⅡA組相比，siAK003290+丹參酮ⅡA組的原代小鼠心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞焦亡顯著升高，表現(xiàn)為焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和caspase-1表達(dá)顯著增多（P<0.05），細(xì)胞上清IL-1β和IL-18含量顯著增加（P<0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

氧化應(yīng)激在心血管疾病發(fā)展過(guò)程中的重要作用越來(lái)越受到關(guān)注，其可引起心肌缺血、心肌缺血再灌注損傷以及心肌重構(gòu)等一系列病理過(guò)程的發(fā)生，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡。心肌細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，不可再生，因此干預(yù)氧化應(yīng)激和減少心肌細(xì)胞損傷成為心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)。本研究采用H2O2構(gòu)建原代小鼠心肌細(xì)胞損傷模型，研究結(jié)果顯示H2O2誘導(dǎo)后原代小鼠心肌細(xì)胞活力顯著降低，同時(shí)存在抗氧化酶SOD和CAT活性顯著降低，表明心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，與前人的研究一致［14］。

丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參主要的脂溶性成分，其心血管保護(hù)作用突出［15］。研究報(bào)道丹參酮ⅡA具有抗氧化作用，能對(duì)抗阿霉素或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［12，16］。本研究結(jié)果表明丹參酮ⅡA也能增強(qiáng)SOD和CAT活性，減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，表明丹參酮ⅡA同樣能減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這與Xu等［17］的研究結(jié)果一致，但具體機(jī)制尚不未完全闡明。

Figure 3.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the AK003290 expression in H2O2-induced primary mouse cardiomyocytes（A）and the effect of siRNA transfection on the AK003290 expression in primary mouse cardiomyocytes（B）.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs40μmol/L TANgroup；▲P<0.05，▲▲P<0.01 vs siNCgroup.圖3 丹參酮ⅡA對(duì)H 2O 2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞AK 003290表達(dá)的影響及敲減AK003290的效果驗(yàn)證

Figure 4.The effect of siAK003290 on the protection of tanshinone IIA（TAN）on viability and antioxidant enzyme activity in H 2O2-in‐duced primary mouse cardiomyocytes.A：cell viability detected by CCK-8 assay；B：superoxide dismutase（SOD）activi‐ty；C：catalase（CAT）activity.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs TAN+H2O2 group.圖4 siAK 003290對(duì)丹參酮ⅡA保護(hù)H 2O 2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞活力和抗氧化酶活性的影響

近年來(lái)，研究證實(shí)細(xì)胞焦亡在心肌損傷中發(fā)揮重要作用，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS活化炎癥小體，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，加重心肌細(xì)胞損傷［18］。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑依賴caspase-1介導(dǎo)［19］，caspase-1切割I(lǐng)L-1β、IL-18及GSDMD，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥和焦亡。細(xì)胞焦亡時(shí)發(fā)生IL-1β和IL-18釋放顯著增加，而GSDMD則被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，其表達(dá)差異可以用來(lái)評(píng)估細(xì)胞焦亡的程度［20］。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和caspase-1表達(dá)顯著增加，同時(shí)炎癥因子IL-1β和IL-18釋放增多，表明H2O2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞損傷模型存有細(xì)胞焦亡，這與葉艷瓊等［7］報(bào)道的一致。而丹參酮ⅡA能夠逆轉(zhuǎn)上述細(xì)胞焦亡指標(biāo)的改變，說(shuō)明丹參酮ⅡA能抑制H2O2誘導(dǎo)原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡。但Tong等［21］報(bào)道丹參酮ⅡA能增強(qiáng)細(xì)胞焦亡并抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，這與本研究中丹參酮ⅡA對(duì)焦亡的調(diào)控效果相反，這種調(diào)控效果的差異可能與細(xì)胞和疾病類(lèi)型不同有關(guān)。

Figure 5.The effect of siAK003290 on the protection of tanshinone IIA（TAN）on pyroptosis of H2O2-induced primary mouse cardio‐myocytes.A：GSDMD and caspase-1 protein expression；B and C：IL-1βand IL-18 levels in cell supernatant.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05，△△P<0.01 vs TAN+H2O2 group.圖5 siAK003290對(duì)丹參酮ⅡA保護(hù)H 2O2誘導(dǎo)的原代小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響

研究報(bào)道丹參酮ⅡA能調(diào)控多種lncRNA發(fā)揮其藥理學(xué)作用［22］，Liu等［10］報(bào)道H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中l(wèi)ncRNA-AK003290表達(dá)降低，AK003290在心臟和肌組織中高表達(dá)，影響肌細(xì)胞的增殖和分化［23］。本研究結(jié)果顯示丹參酮ⅡA能部分恢復(fù)H2O2誘導(dǎo)AK003290低表達(dá)，但丹參酮ⅡA是否通過(guò)調(diào)控AK003290影響H2O2誘導(dǎo)原代小鼠心肌細(xì)胞氧化損傷和焦亡，目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示采用siRNA干擾心肌細(xì)胞AK003290表達(dá)后，丹參酮ⅡA對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用受到限制，同時(shí)細(xì)胞炎癥和焦亡也顯著提升，提示AK003290在丹參酮ⅡA對(duì)抗H2O2心肌細(xì)胞損傷和焦亡中起作用。丹參酮ⅡA如何調(diào)控AK003290及其調(diào)控靶點(diǎn)并不清楚，Zhang等［24］報(bào)道丹參酮ⅡA能通過(guò)lncRNA-HOTAIR/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）減輕對(duì)乙酰氨基酚引起的肝毒性。而NRF2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，Yan等［25］報(bào)道丹參酮ⅡA能夠激活NRF2而減輕心肌細(xì)胞氧化損傷，我們推測(cè)丹參酮ⅡA也可能通過(guò)AK003290調(diào)控NRF2，但有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，丹參酮ⅡA通過(guò)上調(diào)AK003290抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷和焦亡，發(fā)揮其心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究可為丹參酮ⅡA的心血管疾病中應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。