劉 雨，李艷艷，張 偉，楊鳳梅，劉 權(quán)，李詠潔，靳瑋華，段素琴，王俊斌，陳麗雄，徐鴻界，趙 遠(yuǎn)，和占龍

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118）

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是一種似矛頭狀的革蘭陽性雙球菌，成雙或成短鏈狀排列，為人獸共患菌。肺炎鏈球菌是一種條件致病菌，一般定植于健康人群和動(dòng)物的鼻咽部，致病因子為莢膜多糖[1-2]。當(dāng)定植的環(huán)境發(fā)生變化，如宿主機(jī)體免疫力降低或有關(guān)呼吸道病原體感染宿主時(shí)，肺炎鏈球菌會突破機(jī)體的黏膜防御體系，進(jìn)入下呼吸道引起肺炎，或通過咽鼓管進(jìn)入中耳引發(fā)中耳炎，或穿過肺泡上皮細(xì)胞和血管引起菌血癥，或透過血腦屏障引發(fā)腦膜炎等[3-4]。上述由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱為肺炎鏈球菌性疾?。╬neumococcal disease，PD）。據(jù)2017年WHO數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球兒童PD發(fā)病率高達(dá)0.5人次/年，全球每年大約有46萬的兒童死于肺炎鏈球菌感染[5]?？梢姡窝祖溓蚓且饍和l(fā)病和死亡的主要原因之一。

肺炎是人工飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)猴場內(nèi)常見且多發(fā)的疾病之一[6-11]。在人類和動(dòng)物中，引起肺炎的病原體有細(xì)菌、支原體、病毒等，其中細(xì)菌性肺炎大多由肺炎鏈球菌引起。肺炎鏈球菌主要寄居于鼻咽部，是機(jī)體上呼吸道的一種正常定植菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能受損時(shí)，有毒力的肺炎鏈球菌入侵人體而致病。在規(guī)?；斯し庇飯鲩_展早期監(jiān)測，了解和快速確定病原體攜帶狀況，針對性地制定預(yù)防措施，合理選擇抗菌藥物進(jìn)行治療，是有效提高實(shí)驗(yàn)猴場疾病防控能力的重要工作。然而目前實(shí)驗(yàn)猴肺炎鏈球菌攜帶狀況監(jiān)測及快速檢測方法的研究報(bào)告較少，因此開展此項(xiàng)工作對提高實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖水平，確保實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級恒河猴（rhesus macaque，中國獼猴的一個(gè)指名亞種，學(xué)名為Macaca mulatta mulatta）80只（包括嬰猴20只，3～4月齡；成年猴30只，4～10歲；老年猴30只，11～20歲），雌雄不限，均來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長類研究中心[SCXK（滇）K2020-0005]人工繁育超20代的恒河猴種群。這些受檢猴是按照年齡組成結(jié)構(gòu)隨機(jī)抽樣選取，均飼養(yǎng)于普通環(huán)境[SYXK（滇）K2020-0008]。其中，嬰猴小籠飼養(yǎng)，每籠2只；成年猴和老年猴大籠飼養(yǎng)，每籠6～8只；均設(shè)置溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%，飼喂全價(jià)顆粒飼料[SCXK（滇）K2020-0006]，自由飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：DWSP201902034），實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循3R原則，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

實(shí)時(shí)熒光PCR法肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂、葡萄糖肉浸湯、去氧膽酸鈉和菊糖發(fā)酵管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；奧普托欣藥片購自溫州市康泰生物科技有限公司。高速冷凍離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超凈操作臺購自中國蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀器、PowerPac HC高流電泳儀和凝膠成像自動(dòng)分析系統(tǒng)Image Lab購自美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品采集

用無菌棉簽將鼻、咽拭子各分成一式兩份，2～8 ℃保存，分別做培養(yǎng)鑒定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。所有樣本須在2～3 d內(nèi)完成檢測。

1.4 肺炎鏈球菌分離培養(yǎng)及生化鑒定[12]

鼻、咽拭子樣品分別接種在哥倫比亞血培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)灰白色、周圍有草綠色溶血環(huán)、部分呈典型臍窩狀的可疑菌落進(jìn)行革蘭染色。鏡檢顯示形態(tài)呈矛頭狀，成雙或鏈狀排列，寬端相對，尖端相背，顏色為紫色，初步確定為肺炎鏈球菌。

奧普托欣藥敏試驗(yàn)：挑取革蘭染色陽性的菌落均勻密涂于哥倫比亞血培養(yǎng)基上，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將5.0 μg奧普托欣藥片緊壓到平皿中央，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，觀察并測量抑菌圈的直徑大小，抑菌圈大于14 mm時(shí)判定為藥敏陽性。

膽汁溶解試驗(yàn)：挑取革蘭染色陽性的菌落，接種到含有2～3 mL葡萄糖肉浸湯的試管中培養(yǎng)24 h。然后，一支加入1～2滴10%去氧膽酸鈉，另一支加入1～2滴0.9%氯化鈉溶液（即生理鹽水）作為對照，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。觀察發(fā)現(xiàn)液體澄清透明，即確定為膽汁溶解陽性。

菊糖發(fā)酵試驗(yàn)：挑取革蘭染色陽性的菌落，接種到菊糖發(fā)酵管中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察甲酚紫變?yōu)辄S色，即確定為菊糖發(fā)酵陽性。

按照國家標(biāo)準(zhǔn)的肺炎鏈球菌檢測要求，以上3個(gè)試驗(yàn)均為陽性時(shí)，即可確定該樣本為肺炎鏈球菌陽性。

1.5 肺炎鏈球菌核酸檢測

肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）最低檢測限值可達(dá)到1×103拷貝/mL，與感染部位相同或感染癥狀相似且常見的其他病原體如B族鏈球菌、肺炎克雷伯菌、A組乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等細(xì)菌和人類白細(xì)胞的總核酸無交叉反應(yīng)，特異性較好，并且檢測精密度參考品的變異系數(shù)小于5%。具體檢測步驟：（1）新鮮采集的同一只恒河猴鼻、咽拭子樣本混合后經(jīng)葡萄糖肉浸湯培養(yǎng)；（2）取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min后棄掉上清液，保留沉淀；（3）每管沉淀溶于50 μL DNA提取液，沉淀懸浮后100 ℃煮沸5 min；（4）1 000 r/min離心3 min，取5 μL上清液，即肺炎鏈球菌DNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括PCR反應(yīng)組分5 μL、酶混合液0.2 μL、肺炎鏈球菌反應(yīng)液4 μL、無酶水10.8 μL和DNA 5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：Ct≤35且曲線呈S型，判斷為陽性感染；Ct＞38或者未檢出，判斷為陰性感染。

1.6 PCR擴(kuò)增和測序

根據(jù)GenBank肺炎鏈球菌DNA基因序列，利用Prime 5軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的片段長258 bp。上游引物序列為5'-GTTAAGATTGCTGATCGATTAATTGATATCC-3'，下游引物序列為5'-GTAATATGTCTTTAGGGCGTTTATGGCGATAG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用1.5節(jié)中提取的肺炎鏈球菌DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括上下游引物各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、模板DNA 2 μL，dd H2O補(bǔ)至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃停止反應(yīng)。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用定性描述的方法，判斷肺炎鏈球菌感染情況；然后用Excel軟件錄用整理陽性數(shù)據(jù)，計(jì)算不同年齡組的帶菌率。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)特征

在哥倫比亞血瓊脂平板上接種鼻、咽拭子樣品，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)80份樣品有4份嬰猴樣品為陽性，菌落為灰白色濕潤的凸起，且周圍有草綠色溶血環(huán)，呈臍窩狀，總體表現(xiàn)為典型肺炎鏈球菌的菌落特征（圖1A）。革蘭染色后鏡檢結(jié)果顯示，該細(xì)菌為革蘭陽性鏈球菌，菌體呈成雙或短鏈狀排列（圖1B），進(jìn)一步確定為肺炎鏈球菌。對結(jié)果為陽性的4只嬰猴對應(yīng)的母猴（不包括在30只成年猴中）鼻咽拭子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，均未培養(yǎng)出肺炎鏈球菌。

2.2 肺炎鏈球菌的生化特性

奧普托欣藥敏試驗(yàn)測得抑菌圈直徑大小為16 mm（圖2A）。抑菌圈大于14 mm表明該菌對奧普托欣敏感，即可確定為陽性。膽汁溶解試驗(yàn)中，加入10%去氧膽酸鈉溶液的試管液體澄清透明，加入生理鹽水的試管液體渾濁（圖2B），表明膽汁溶解試驗(yàn)為陽性。菊糖發(fā)酵試驗(yàn)中，接種菌落的菊糖發(fā)酵管中甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，加入生理鹽水的菊糖發(fā)酵管中液體顏色沒有變化，表明該菌可發(fā)酵菊糖（圖2C），即菊糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽性。通過以上試驗(yàn)可確定分離獲得的菌落為肺炎鏈球菌。

圖 2 嬰猴感染肺炎鏈球菌的生化鑒定Figure 2 Biochemical identification of Streptococcus pneumoniae in infant rhesus macaques

2.3 肺炎鏈球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩查結(jié)果

鼻咽拭子樣本通過提取DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)嬰猴中4份樣本檢測結(jié)果為陽性，成年猴和老年猴檢測結(jié)果均為陰性；對結(jié)果為陽性的嬰猴的母親（不包括在30只成年猴中）進(jìn)行PCR檢測，篩查結(jié)果均為陰性（圖3）。

圖 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同年齡組的恒河猴肺炎鏈球菌攜帶情況Figure 3 Carriage of Streptococcus pneumoniae in rhesus macaques at different ages detected by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 肺炎鏈球菌PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果

用根據(jù)肺炎鏈球菌DNA序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，目的片段長度為258 bp（圖4A）。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果如圖4B所示。擴(kuò)增的目的片段序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA序列的同源性達(dá)97.6%以上。

圖 4 嬰猴肺炎鏈球菌感染陽性樣本的PCR擴(kuò)增（A）和測序（B）結(jié)果Figure 4 PCR amplification (A) and sequencing (B) results in positive samples of Streptococcus pneumoniae infection in infant rhesus macaques

2.5 不同年齡組恒河猴的肺炎鏈球菌攜帶情況

在3～4月齡恒河猴嬰猴的鼻、咽拭子中檢測出肺炎鏈球菌，檢出率為20%（4/20）。另外對檢測結(jié)果陽性的4只嬰猴的母親進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)4只母猴（30只成年猴中不包括這4只母猴）并未攜帶肺炎鏈球菌。4～20歲年齡組的恒河猴咽拭子、鼻拭子均未檢測出肺炎鏈球菌。經(jīng)過對比標(biāo)號發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)和PCR篩查的陽性結(jié)果均一致。不同年齡組恒河猴的肺炎鏈球菌攜帶情況見表1。

表 1 不同年齡組恒河猴肺炎鏈球菌的攜帶情況Table 1 Carriage of Streptococcus pneumoniae in different age groups of rhesus macaques

3 討論

正常菌群是微生物與其宿主在共同的進(jìn)化過程中形成的對人有益的微生物群，主要存在于人類體表和體腔部位，這些正常菌群大部分與細(xì)胞密切接觸并參與人體能量供給、物質(zhì)交換、遺傳信息傳遞等生命活動(dòng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)在人體鼻腔的定植微生物以葡萄球菌為最多，其次是肺炎鏈球菌、奈瑟菌、嗜血流感桿菌等。鼻咽部鏈球菌與嗜血流感桿菌的數(shù)量大，肺炎鏈球菌占比較高。多年來人們主要關(guān)注口腔鼻咽部正常菌群的致病作用，即引起內(nèi)源性感染的作用，忽視了這些菌群正常的生物拮抗、營養(yǎng)及免疫等生理作用。正常情況下，口腔鼻咽部正常菌群之間以及菌群中多種微生物之間，互相依存，互相制約，構(gòu)成一種生態(tài)平衡，發(fā)揮著重要的生理作用?；诜侨遂`長類動(dòng)物與人的生理結(jié)構(gòu)和功能以及遺傳信息具有相似性，本研究開展了正常猴群中肺炎鏈球菌在咽鼻部定植情況的篩查，為早期該病原體的檢測提供一定的參考依據(jù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在正常猴群中肺炎鏈球菌攜帶率相對較高，如環(huán)境、個(gè)體免疫力等因素一旦發(fā)生改變將會引起肺炎的發(fā)生。因此，在實(shí)踐工作中檢測肺炎鏈球菌的同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對動(dòng)物口腔鼻咽部其他常見的正常菌群中多種微生物的監(jiān)測和研究，建立一個(gè)完善的可檢測多種微生物的技術(shù)方法，獲得非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的咽鼻部微生物信息數(shù)據(jù)，從而指導(dǎo)飼養(yǎng)、質(zhì)量檢測和疾病防控等。

大量研究表明，在豬、羊、貂、兔等動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了PD[14-17]。有文獻(xiàn)資料顯示，導(dǎo)致猴呼吸系統(tǒng)疾病的常見且重要的病原菌為肺炎鏈球菌，死亡率高達(dá)82%[18]。鄭振峰等[6]報(bào)告猴肺炎鏈球菌是導(dǎo)致呼吸道疾病的第二大病原菌。這些文獻(xiàn)資料的數(shù)據(jù)結(jié)果大多數(shù)是在實(shí)驗(yàn)猴出現(xiàn)臨床癥狀或死亡的樣本中獲得，而在正常恒河猴群體中調(diào)查報(bào)告肺炎鏈球菌攜帶情況的文獻(xiàn)較少。據(jù)報(bào)告，中國內(nèi)地健康兒童鼻咽部肺炎鏈球菌的攜帶率為21.7%，其中幼兒園兒童（2～5歲）的攜帶率高達(dá)25.0%[19]。本研究分別從恒河猴群體的嬰猴、成年猴和老年猴中隨機(jī)抽取20只、30只、30只進(jìn)行肺炎鏈球菌攜帶情況篩查，結(jié)果顯示，20只3～4月齡的嬰猴中有4只的鼻咽部肺炎鏈球菌為陽性，16只為陰性；但4只陽性嬰猴的親代母猴中并未檢測出肺炎鏈球菌。因此，推測本研究中嬰猴所攜帶的肺炎鏈球菌并非經(jīng)垂直傳播，而是自然感染狀態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌有96個(gè)血清型[20-22]，其中確定的致病性血清型約20～30種。本次檢測結(jié)果為陽性的嬰猴均未發(fā)生肺炎情況，推測所檢測到的肺炎鏈球菌可能不屬于致病性血清型，也有可能是由于攜帶（定植）載量較低，或者與動(dòng)物機(jī)體抵抗力等因素有關(guān)。因此，本課題組后期將對分離到的肺炎鏈球菌進(jìn)一步開展血清型鑒定，并跟蹤觀察動(dòng)物健康狀況。

陳文標(biāo)等[23]和王哲等[24]發(fā)現(xiàn)，不同年齡、不同季節(jié)時(shí)人類肺炎鏈球菌感染的分布有一定差異性，但總體而言，小于5歲的兒童和大于50歲的老年人發(fā)病率較高。推測其原因主要是嬰兒剛出生時(shí)會從母體獲得一部分免疫力，而3個(gè)月后免疫力逐漸喪失，且3個(gè)月～2歲的兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，容易受到病原菌感染；老年人由于機(jī)體功能逐漸退化，運(yùn)動(dòng)減少，多伴有基礎(chǔ)疾病，抵抗力較弱，相對于年輕人更易感染。而本研究結(jié)果顯示，3～4月齡的嬰猴肺炎鏈球菌攜帶率達(dá)20%，但在成年猴、老年猴中未檢測到肺炎鏈球菌。推測這可能與環(huán)境和飼養(yǎng)密度有一定關(guān)系。本次研究的嬰猴飼養(yǎng)在飼養(yǎng)室內(nèi)，提供保溫、空氣凈化等設(shè)備，但每個(gè)籠內(nèi)飼養(yǎng)2只，動(dòng)物密切接觸、飼養(yǎng)密度較高等因素可能導(dǎo)致肺炎鏈球菌攜帶率較高；而成年猴和老年猴飼養(yǎng)在室外大籠內(nèi)，飼養(yǎng)密度低、空氣流通和日光中紫外線照射等較好的環(huán)境因素不利于肺炎鏈球菌的定植，另外動(dòng)物長期接觸同一外界環(huán)境的過程中可能導(dǎo)致微生物菌群發(fā)生適應(yīng)性的變化。需要說明：在生產(chǎn)實(shí)踐中老年猴群的肺炎發(fā)病率相對較高，因此尤其要做好確診為肺炎或者因肺炎死亡的病例的病原體檢測、分離和培養(yǎng)，才能積極有效地開展預(yù)防及治療工作。

本次調(diào)查結(jié)合分子生物學(xué)手段和微生物學(xué)手段，對恒河猴群體中肺炎鏈球菌的攜帶情況進(jìn)行篩查和鑒定，探究不同年齡階段的恒河猴體內(nèi)肺炎鏈球菌的攜帶率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下嬰猴為肺炎鏈球菌的主要攜帶群體，其攜帶率約為20%，該結(jié)果與人類兒童中肺炎鏈球菌的感染情況相近。未來可進(jìn)一步對所分離到的肺炎鏈球菌進(jìn)行亞型鑒定和菌株毒理實(shí)驗(yàn)，為肺炎球菌感染的臨床診斷和防治提供進(jìn)一步的基礎(chǔ)依據(jù)。