肖 攀，牛廷獻，羅曉紅，王紅義，郭曉宇，陸 璐，馮小明

（1. 聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室，蘭州 730050；2聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院內分泌科，蘭州 730050）

我國高原地區(qū)急性重型高原病并發(fā)多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)病率較高[1-2]。高原多臟器功能障礙綜合征（high altitude multiple organ dysfunction syndrome，H-MODS）在本質上與平原地區(qū)發(fā)生的MODS沒有區(qū)別，但是受低氧等高原特殊環(huán)境的影響，H-MODS在病程及臨床發(fā)病特征方面具有一定的高原特異性，使其在臨床治療中顯得更為復雜和危險[3]。本課題組前期采用具有高原特性的蕨麻豬成功建立了H-MODS動物模型[4-6]，并發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質酮（corticosterone，CORT）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）在H-MODS模型蕨麻豬的病程發(fā)展過程中發(fā)生明顯變化。本研究在此基礎上進一步探討內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導多臟器損傷后，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等炎性指標的變化特點，以期了解H-MODS蕨麻豬模型發(fā)病過程中機體炎性反應的變化特征。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

高原蕨麻豬24只，雌雄各半，體質量為15 kg左右。所有蕨麻豬按雌雄各半隨機分為H-MODS蕨麻豬模型LPS高、中、低劑量組和對照組，每組6只。蕨麻豬為甘南地區(qū)散戶飼養(yǎng)（符合普通級實驗動物要求），檢測實驗在本實驗室[SYXK（軍）2017-0046]進行，嚴格遵照動物實驗福利倫理各項要求進行操作。CRP檢測用ELISA試劑盒購自英國Abcam公司，IL-1β與TNF-α檢測用ELISA試劑盒均購自美國R＆D公司。氯胺酮（國藥準字：H35020148）購自福建古田藥業(yè)有限公司，地西泮注射液（國藥準字：H12020957）購自天津金耀氨基酸有限公司，LPS（血清型為O127: B8，批號為64H4010）購自美國Sigma公司。

1.2 H-MODS模型建立方法

建模方法參照文獻[4-7]。本實驗在海拔3 500 m的甘南桑科草原進行，將豬運到實驗地點適應性飼養(yǎng)3 d，待動物狀態(tài)穩(wěn)定后進行實驗。采用氯胺酮（6 mg/kg）聯(lián)合安定（0.5 mg/kg）肌內注射法進行動物麻醉，同時肌內注射阿托品（0.05mg/kg）。動物麻醉后經(jīng)耳緣靜脈泵入LPS，每組泵入時間均控制在30 min左右，低、中、高劑量組的泵入劑量分別為0.25 mg/kg（B組）、0.35 mg/kg（C組）和0.50 mg/kg（D組），對照組（A組）以等量的生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）代替。經(jīng)過前期實驗發(fā)現(xiàn)，采用LPS高、中、低這3個劑量來誘導蕨麻豬多臟器損傷建立H-MODS模型，都可以引起蕨麻小型豬的生理生化指標發(fā)生變化，同時中、高劑量組豬均出現(xiàn)死亡，提示3個劑量的LPS都可以成功建立H-MODS模型。

1.3 MODS的診斷標準

參照胡森等[7]提出的動物發(fā)生MODS時各個器官功能障礙分期診斷標準和評分標準，在注射LPS后出現(xiàn)2個或2個以上器官或系統(tǒng)功能障礙時判定為MODS。

1.4 血清采集

3組豬分別于泵入LPS后0 h、3h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，經(jīng)頸靜脈采血，分離血清，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA檢測指標

IL-1β、TNF-α與CRP表達水平的檢測由本實驗室按照ELISA試劑盒說明書操作完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對檢測結果進行分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 炎性因子TNF-α的變化

靜脈泵入LPS后，B、C、D組TNF-α表達量急劇升高，在6 h時升至最高，之后逐漸下降；在3～12 h時B、C、D組與同組0 h和同時間點A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；24 h時B、D組與同組0 h和同時間點A組相比，均明顯升高（P＜0.05）；72h時B組明顯高于A組（P＜0.05）。TNF-α表達量情況與走勢詳見表1和圖1。

2.2 炎性因子IL-1β的變化

低、中、高劑量組在注入LPS后，IL-1β表達量均開始上升，并在6 h時達到峰值；在3～12 h時B、C、D組與0 h和A組相比，其表達量均有明顯升高（P＜0.05或P＜0.01)；24 h時D組高于0h和A組（P＜0.05）。之后各組IL-1β表達量逐漸降低，在48 h、72 h時B、C、D組與0 h和A組相比，均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。從各劑量組的表達量來看，高劑量組的IL-1β表達水平高于低劑量組。IL-1β表達量情況與走勢詳見表1和圖1。

表 1 各組蕨麻豬給予LPS不同時點的TNF-α、IL-1β和CRP水平比較Table 1 Comparison of TNF-α, IL-1β and CRP levels at different time points in Juema pigs after different LPS infusion treatments( ± s, n=6)

表 1 各組蕨麻豬給予LPS不同時點的TNF-α、IL-1β和CRP水平比較Table 1 Comparison of TNF-α, IL-1β and CRP levels at different time points in Juema pigs after different LPS infusion treatments( ± s, n=6)

注：TNF-a即腫瘤壞死因子-a，IL-1b即白細胞介素-1b，CRP即C反應蛋白。A為對照組，通過耳緣靜脈注入等量的生理鹽水；B～D分別為低、中、高劑量組，即分別經(jīng)耳緣靜脈泵入0.25mg/kg（B組）、0.35mg/kg（C組）、0.50mg/kg（D組）的脂多糖（LPS）。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與0h相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 0 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 7 2 h TNF-α ρ/(pg·mL-1) A B C D IL-1β ρ/(pg·mL-1) A B C D CRP ρ/(μg·mL-1) A B C D 96.52±10.21 100.87±9.95 94.98±10.26 98.93±7.20 101.84±21.10 212.54±78.21**△△1 058.35±99.68**△△1 145.73±65.99**△△ 93.24±9.65 1 255.91±153.41**△△1 076.56±42.89**△△1 233.61±93.60**△△ 118.35±11.36 1 071.01±122.1**△△ 615.30±96.11*△ 681.92±103.46*△ 105.28±10.89 190.61±16.04*△ 117.68±14.40 156.35±17.20*△98.64±12.25 86.12±26.33 69.36±65.67 76.71±19.65 91.68±9.32 147.39±11.70*△128.56±13.34 133.66±32.08 66.25±21.41 60.43±6.49 57.32±4.05 65.71±11.24 59.14±16.32 187.59±16.34*△ 243.33±112.12**△△ 469.26±17.86**△△ 50.28±22.81 271.43±94.95**△△1 373.57±489.92**△△2 155.14±328.30**△△ 65.34±19.64 113.59±22.58*△ 542.14±261.27**△△ 936.43±57.58**△△ 58.23±28.25 42.14±17.17 80.71±52.22 90.48±19.20*△70.17±11.25 21.58±5.57*△△31.42±6.62*△14.28±8.08**△△ 63.58±31.35 22.37±8.35*△ 28.70±8.19*△ 16.43±5.91*△△ 11.23±2.52 12.38±4.51 10.91±2.26 14.23±3.96 13.78±3.45 19.26±3.84 18.48±4.01* 22.77±6.86△ 14.46±4.98 27.02±6.96*△ 28.69±3.56**△ 29.77±6.65*△ 15.49±2.47 35.44±5.21**△ 40.79±8.21*△△ 43.38±8.31**△ 10.33±3.64 41.93±8.11*△ 45.72±7.38**△△ 50.85±3.81**△△15.74±2.58 33.67±7.65*△42.22±4.49*△△53.08±5.50**△△ 12.11±4.14 29.32±4.77*△ 34.36±5.85*△ 40.46±6.35*△

2.3 CRP的變化

靜脈泵入LPS后，B、C、D組CRP表達量開始升高，B、C組在24 h時表達量達到最大，D組在48 h時表達量達到最大，之后各組表達量開始逐漸下降；B組6～72 h時CRP表達量與0 h和A組相比，均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；C組6～72 h時CRP表達量與0 h和A組相比均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 h時CRP表達量與A組相比明顯升高（P＜0.05）；D組6～72 h時CRP表達量與0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中3 h時CRP表達量與0 h相比明顯升高（P＜0.05）。從各劑量組的表達量來看，高劑量組的CRP表達水平略高于低劑量組。CRP表達情況與走勢詳見表1和圖1。

3 討論

本研究通過LPS致蕨麻豬多臟器損傷而建立H-MODS模型，并在建立模型時選用高、中、低3個劑量。前期實驗結果顯示，高、中、低劑量的LPS均可引起蕨麻豬生理生化指標的變化，且中、高劑量LPS可誘導蕨麻豬發(fā)生多臟器損傷[5]。目前，IL-1β、TNF-α與CRP已廣泛用來反映臨床疾病發(fā)生時的炎性反應及病程變化程度[8-9]，并且這些指標在全身炎性反應及多臟器損傷疾病的診療中具有臨床指導意義[10-11]。因此，本研究進一步利用蕨麻豬H-MODS模型，對蕨麻豬發(fā)生MODS時的炎性因子IL-1β、TNF-α與CRP進行檢測，以期探討H-MODS發(fā)生、發(fā)展中炎性反應的變化特點。

TNF-α由淋巴細胞和單核巨噬細胞分泌，是典型的促炎性因子，通過對細菌內毒素反應而參與炎性反應[12]，導致組織細胞破壞。TNF-α可引起內皮損傷，造成炎性反應發(fā)生，同時可激活巨噬細胞和中性粒細胞，增強其吞噬和殺傷性，對相關炎性因子有介導作用，從而引起器官組織的損傷[13]。IL-1是一種前炎性細胞因子，主要通過修飾基因達到對免疫炎性反應的調節(jié)作用。IL-1的基因結構與其調節(jié)功能密切相關，并且內皮損傷可刺激內皮細胞釋放IL-1[14]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MODS模型也會引起TNF-α與IL-1β表達量出現(xiàn)上調[15-16]。本研究中TNF-α與IL-1β在LPS誘導MODS形成后表達量急劇升高，在6h時升至最高，之后逐漸下降。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組蕨麻豬出現(xiàn)死亡；在蕨麻豬形成H-MODS時，其體內出現(xiàn)嚴重的應激感染狀態(tài)；隨著炎性反應逐漸增強，炎性因子TNF-α與IL-1β的表達也出現(xiàn)不同程度的上調；隨后機體進入動態(tài)免疫調節(jié)階段，抑制過度炎性反應，維持機體的平衡；在6 h后TNF-α與IL-1β表達水平開始慢慢降低，在72 h時IL-1β表達水平甚至低于對照組和0 h。以上結果提示，機體發(fā)生炎性反應后出現(xiàn)免疫應激反應，通過迅速的免疫調節(jié)快速下調炎性因子表達。

CRP是由肝細胞分泌的一種非特異性生化標志物的炎性因子，其表達量的增加與機體受到刺激引起的炎性反應關系緊密。同時，CRP作為一種急性反應蛋白能夠快速反映出機體的慢性或急性炎癥狀態(tài)[17]。CRP會激活單核細胞，誘導血管內皮細胞功能紊亂，促進其他炎性因子的釋放，最終誘導多臟器損傷。當機體受到外界LPS的作用時，多臟器出現(xiàn)不同程度的損傷，炎性反應開始加劇，CRP表達量就會迅速升高。此外，CRP能夠誘導氧自由基產(chǎn)生，因此在炎性反應出現(xiàn)時IL-6、TNF-α等炎性因子開始大量釋放；并且伴隨著炎性反應的加劇，CRP還能夠誘導血小板激活，加重心肌組織、腎臟組織微循環(huán)障礙[18]，使得炎性反應持續(xù)加劇。本研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻豬泵入LPS誘導多臟器出現(xiàn)損傷時，低、高、中劑量組的CRP表達量開始升高，并在6 h時與0 h和對照組相比明顯升高；各組均在24～48 h表達量達到最大，在72 h后才緩慢降低。

目前，臨床上廣泛采用CRP、TNF-α及IL-1等炎性因子來評價患者疾病感染情況以及臨床治療效果，這些炎性因子已經(jīng)成為臨床評價病情及治療效果的標志之一[19-22]。本研究中蕨麻豬經(jīng)LPS誘導發(fā)生多臟器炎性反應后，其TNF-α及IL-1β表達量在6 h達到最大，之后開始快速降低，到48 h已經(jīng)接近恢復正常；而CRP在6 h時處于上升期，到48 h才達到頂峰，之后緩慢回落。由此可以看出，在LPS誘導蕨麻豬形成H-MODS時，炎性因子TNF-α及IL-1β在體內表達量迅速上升再下降，相對而言，CRP的表達持續(xù)時間長且變化比較緩慢，這可能是因為各個因子的分泌器官及場所不同。因此，在評價HMODS炎性反應的發(fā)展變化時，應該對病程隨時監(jiān)測，根據(jù)各檢測指標的變化來評估炎性反應的程度，以便及時調整治療方案。臨床研究顯示，膿毒癥患者與H-MODS患者的TNF-α及CRP具有相近的變化特點[23-24]。在H-MODS發(fā)生發(fā)展過程中，炎性反應及免疫反應貫穿整個疾病的發(fā)展始末，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間伴隨著免疫反應調節(jié)，最終取得平衡以達到內環(huán)境的穩(wěn)定，所以TNF-α及IL-1β炎性指標的變化呈現(xiàn)迅速的拋物線形趨勢，這種變化趨勢使得機體的炎性反應及時得到調整，不會出現(xiàn)過度抗炎性反應及免疫功能抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻豬模型HMODS形成時機體產(chǎn)生嚴重的炎性反應，炎性因子TNF-α、IL-1β表達迅速升高，這時免疫調節(jié)作用也迅速對炎性因子高表達進行反向調節(jié)，迅速下調TNF-α、IL-1β的表達水平，所以機體出現(xiàn)炎性反應時炎性因子的變化特點是短時間內出現(xiàn)急劇波動，且會經(jīng)免疫調節(jié)快速達到平衡狀態(tài)；相對而言，CRP表達的變化比較緩慢，其表達量表征著機體炎性反應的整個過程。

綜上所述，研究H-MODS發(fā)生、發(fā)展過程中炎性因子及CRP的變化特點，將有助于人們準確預判H-MODS的病程發(fā)展，為進一步深入探討H-MODS的致病機制提供理論參考，并且對H-MODS的臨床精準診斷及治療具有重要的指導意義。