向媛嫄,王文林,宋海云,黃雪松*

1(暨南大學(xué) 理工學(xué)院,廣東 廣州,510632) 2(廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西 崇左,532415)

澳洲堅(jiān)果(MacadamiaternifoliaF.Muell),又稱(chēng)夏威夷果、澳洲核桃等,是一種亞熱帶堅(jiān)果,產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州和新南威爾士州等,屬山龍眼科[1]。脫脂或低脂澳洲堅(jiān)果油粕粉作為澳洲堅(jiān)果油生產(chǎn)的副產(chǎn)品,可作為食品和飲料中營(yíng)養(yǎng)豐富的配料[2],其含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖和糖肽[3]。研究糖鏈對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽各種功能性質(zhì)的影響對(duì)開(kāi)發(fā)澳洲堅(jiān)果油粕粉產(chǎn)品有一定的指導(dǎo)作用。

糖基化反應(yīng)是一種生物體內(nèi)很普遍的翻譯后修飾的過(guò)程,常常影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性[4]。DEN STEEN等[5]使用核磁共振評(píng)估了糖基化的糖肽片段,18 kDa的蛋白質(zhì)被高度糖基化,核心O-糖鏈與肽相互作用,被約束為特定構(gòu)象,使肽主鏈更加穩(wěn)定;王岸娜等[6]發(fā)現(xiàn)除去獼猴桃糖蛋白O-糖鏈會(huì)破壞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊,從而降低糖蛋白的抗氧化性;此外糖鏈還可以保護(hù)半胱氨酸免受氧自由基的攻擊[7]。就蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)而言,糖鏈的釋放必將會(huì)導(dǎo)致肽鏈的重新折疊從而影響肽鏈的結(jié)構(gòu),在某些情況下這些結(jié)構(gòu)影響其功能。例如葡糖淀粉酶用α-甘露糖酶處理后酶活性降低[8],說(shuō)明葡糖淀粉酶的O-糖鏈在淀粉水解中起重要作用。因此研究多糖對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響對(duì)于改造和利用豐富的蛋白資源很有必要。本文用β-消除法釋放澳洲堅(jiān)果糖肽中的O-糖鏈,通過(guò)圓二色譜儀觀察去糖基化前后澳洲堅(jiān)果糖肽中肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)變化;差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)分析去糖基化對(duì)其熱穩(wěn)定性的影響;掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)變化,測(cè)定去糖基化前后澳洲堅(jiān)果糖肽體外抗氧化活性的變化。研究了糖基化對(duì)澳洲堅(jiān)果糖肽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果油粕,廣西省岑溪市壽香鄉(xiāng)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司；DEAE-52 纖維素,美國(guó)GE 公司；Sephadex G-100 凝膠,上海源葉生物科技有限公司；DPPH、濃硫酸、鹽酸、NaCl,均為分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、三氯乙酸、雙氧水、苯酚,均為分析純,廣州化學(xué)試劑廠；SDS-PAGE超低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品,廣州碩譜生物科技公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10 N冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-9600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器公司；LC-20A高效液相色譜儀、TM3030Plus型掃描電子顯微鏡,日本島津公司；DSC-1差示掃描量熱儀,梅特勒-托利多公司；圓二色光譜儀,英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 澳洲堅(jiān)果糖肽的提取純化

分離：取冷榨脫脂澳洲堅(jiān)果油粕粉250 g,加入2 L蒸餾水,60 ℃水浴加熱2 h。冷卻離心(3 500 r/min,20 min)保留上清液,減壓濃縮；向濃縮液中加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%,離心(3 500 r/min,20 min)除去蛋白質(zhì)等沉淀物,收集上清液繼續(xù)加無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,離心(3 500 r/min,20 min)收集沉淀物。重新溶解并減壓濃縮,冷凍干燥得澳洲堅(jiān)果糖肽粗提物。

純化：取澳洲堅(jiān)果糖肽粗提物250 mg,溶于10 mL蒸餾水。充分溶解后上樣到DEAE-52纖維層析柱中,分別用0、0.1、0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫,收集洗脫液每管10 mL。測(cè)每管溶液在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度,苯酚-硫酸法測(cè)量每管溶液在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。以管數(shù)序號(hào)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線(xiàn)。收集既有糖又有蛋白的樣品峰,濃縮后用8 kDa透析袋透析。取適量上述溶液上樣到Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析柱中,蒸餾水緩慢洗脫,收集洗脫液每管5 mL,同樣的方法在波長(zhǎng)280和490 nm處測(cè)每管洗脫液吸光度,收集糖肽樣品峰,透析凍干,得率為3.5%。

1.2.2 糖肽的純度和分子質(zhì)量鑒定

通過(guò)高效液相色譜凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定澳洲堅(jiān)果糖肽(macadamia glycopeptiole,MGP)的純度[9],采用PolySep-GFC-P4000柱(7.8 mm×300 mm),以蒸餾水為流動(dòng)相,進(jìn)樣量10 μL,流速0.5 mL/min,檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射器(evaporative light-scattering detector,ELSD)。

用超低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定糖肽的分子質(zhì)量,該標(biāo)品由3種多肽和2種低分子質(zhì)量蛋白組成,分子質(zhì)量分別為20 100、14 400、7 823、5 856、3 313 Da。采用Tricine-甘油SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量，根據(jù)文獻(xiàn)[10]制備凝膠液和電泳液。

根據(jù)表1制備分離膠,聚合后制備夾層膠,最后制備濃縮膠。3種膠長(zhǎng)度比為4∶1.5∶1。電壓：30 V 1 h,100 V至結(jié)束。電泳之后將膠在固定液中固定10～20 min,再進(jìn)行染色,一般染色20～30 min即可脫色。

表1 電泳膠配制表Table 1 Preparation of electrophoresis gel

1.2.3 糖苷鍵組成

β-消除法[11]除去糖鏈：500 mg糖肽與5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液和5 mL 1 mol/L硼氫化鈉溶液混合,35 ℃反應(yīng)24 h,2 kDa透析袋透析24 h。濃縮凍干得到澳洲堅(jiān)果糖肽的肽鏈(macadamia glycopeptide peptide,MGPP)。比較反應(yīng)前后樣品在波長(zhǎng)240 nm處的紫外吸收是否有變化,以此確定糖肽中是否存在O-糖肽鍵。

1.2.4 圓二色譜分析

將MGP和MGPP溶于水配成0.1 mg/mL的溶液,用10 mm 光徑樣品池掃描(波長(zhǎng)260～190 nm),掃描速度100 nm/min,響應(yīng)時(shí)間1 s。

1.2.5 DSC分析

使用DSC測(cè)定MGP和MGPP在水溶液中的變性溫度。稱(chēng)取MGP和MGPP配成0.5 mg/mL水溶液,分別取50 μL于鋁盒中。氮?dú)饬魉僭O(shè)定20 mL/min,在25～200 ℃ 掃描,升溫速率為25 ℃/min ,得到曲線(xiàn)。

1.2.6 掃描電子顯微鏡分析

導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái),取微量?jī)龈蓸悠稭GP和MGPP均勻地粘在導(dǎo)電膠上,吹去浮沫,噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.7 體外抗氧化能力測(cè)定

(1)DPPH自由基清除率的測(cè)定[12]

用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液配制0.2 mmol/L DPPH溶液,取2 mL置于試管中,加入2 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的MGP和MGPP樣品溶液,旋渦混勻,室溫下反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。DPPH自由基清除率根據(jù)公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：A1,待測(cè)樣品的吸光度；A2,95%乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度；A0,95%乙醇溶液代替樣品的吸光度。

(2)·OH清除率的測(cè)定[13]

取樣品2 mL,加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2,旋渦混勻反應(yīng)10 min后加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸混勻,室溫靜置30 min,510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。·OH清除率根據(jù)公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：A1,待測(cè)樣品的吸光度；A2,雙蒸水代替H2O2測(cè)得的吸光度；A0,水代替樣品測(cè)得的吸光度。

(3)還原力的測(cè)定[13]

2 mL樣品中加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2 mL 10 g/L的鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min,室溫放置冷卻后加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液,混勻后取出2 mL,與2 mL蒸餾水以及0.4 mL 1 g/L的FeCl3溶液混勻,靜置10 min,在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,還原力與吸光度成正比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

3次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,使用Excel 2019數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Origin 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化分析結(jié)果

由圖1-a可知，經(jīng)DEAE-52洗脫后出現(xiàn)3個(gè)吸收峰,其中0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫部分(峰2)既有蛋白又有糖的吸收,即該濃度洗脫部分應(yīng)為糖肽,而且含量最多。收集該洗脫部分,透析凍干后經(jīng)過(guò)Sephadex G-100凝膠柱洗脫,得到2個(gè)既有蛋白又有糖吸收的峰(圖1-b)；收集主峰(圖1-b中的4峰)透析凍干,得純澳洲堅(jiān)果糖肽,命名為MGP。

a-DEAE-52纖維素洗脫圖；b-Sephadex G-100凝膠柱洗脫圖圖1 MGP分離純化圖Fig.1 MGP separation and purification diagram

2.2 純度和分子質(zhì)量

MGP經(jīng)HPLC的純度鑒定結(jié)果如圖2-a所示,HPLC圖譜呈現(xiàn)窄的單一對(duì)稱(chēng)峰,可認(rèn)為MGP是均一糖肽,保留時(shí)間為9.741 min。Tricine-甘油 SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2-b所示,因?yàn)樘请闹械奶擎溣性S多為不對(duì)稱(chēng)形結(jié)構(gòu),糖單元具有不均一性,這種非均一性源于寡糖鏈接位點(diǎn)的非均一性和連接于同一位點(diǎn)上寡糖的非均一性[14]。導(dǎo)致含糖蛋白質(zhì)的電泳行為與一般蛋白質(zhì)有所不同,多糖復(fù)合物解離程度較微弱,電荷密度低,糖肽的電泳帶呈帶狀分布[15]；MGP的電泳圖亦見(jiàn)到此現(xiàn)象。小分子肽在電泳過(guò)程中本身就會(huì)出現(xiàn)彌散現(xiàn)象,使電泳帶比一般的蛋白電泳帶寬,與本文中MGPP和標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳行為相符合。溴酚藍(lán)為指示劑,其遷移率為1.0,以蛋白和多肽的相對(duì)遷移率對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-2.185 5x+5.030 7(R2=0.995 9)。根據(jù)MGP和MGPP的相對(duì)遷移率求得MGP的分子質(zhì)量約為12 kDa,MGPP的分子質(zhì)量約為9 kDa。

a-MGP的高效液相色譜圖；b-Tricine-甘油SDS-PAGE電泳圖1-MGPP；2-MGP；3-標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量圖2 純度和分子質(zhì)量鑒定圖Fig.2 Identification diagram of purity and molecular mass

2.3 糖苷鍵類(lèi)型

MGP經(jīng)β-消除后,240 nm波長(zhǎng)處吸光度明顯增加(圖3),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的絲氨酸或蘇氨酸與多糖結(jié)合形成O-糖肽鍵時(shí),稀堿處理(即發(fā)生β-消除反應(yīng))會(huì)發(fā)生解離,絲氨酸或蘇氨酸殘基會(huì)形成α-氨基丙烯酸或α-氨基丁烯酸,在240 nm波長(zhǎng)處有特征吸收[16]。據(jù)此可以推斷：MGP中糖和肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)O-糖肽鍵連接的。

圖3 β-消除反應(yīng)前后紫外掃描光譜圖Fig.3 UV scan spectrum before and after β-elimination reaction

2.4 圓二色譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要通過(guò)非共價(jià)力維持,當(dāng)分子內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時(shí),蛋白分子將重新排列,達(dá)到最低能量以維持相對(duì)穩(wěn)定[17]。根據(jù)凝膠電泳測(cè)得的分子質(zhì)量對(duì)MGP(12 kDa)和MGPP(9 kDa)的圓二色譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到2種多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量如表2所示。MGP經(jīng)β-消除后所獲得的MGPP,其二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋含量降低9.3%；β-折疊含量降低21%；β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲含量分別增加1.6%、28.7%。這表明糖基化會(huì)使MGP肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定有序,這是因?yàn)楦咚降摩?螺旋、β-折疊含量高有助于肽鏈形成更緊密的蛋白結(jié)構(gòu)或分布,改善蛋白的穩(wěn)定性[18]。

表2 β-消除前后二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分相對(duì)含量 單位:%

2.5 DSC分析結(jié)果

蛋白質(zhì)只有在水中才能呈現(xiàn)出特定的三維立體結(jié)構(gòu)來(lái)支撐蛋白質(zhì)的各種功能性質(zhì)[19],因此蛋白質(zhì)的熱變性溫度即蛋白質(zhì)在水溶液中的變性溫度。MGP溶液和MGPP溶液的DSC曲線(xiàn)如圖4所示,曲線(xiàn)的最大吸收峰值所對(duì)應(yīng)的溫度和峰面積即它們的熱變性溫度(Td)和焓變值(ΔH)[19]。MGP的熱變性溫度Td=148 ℃,焓變值ΔH=0.207 kJ/g；MGPP的Td=136 ℃,ΔH=0.138 kJ/g。Td反映熱穩(wěn)定性,ΔH反映變性所需要的熱量,ΔH越大表明有序結(jié)構(gòu)越多,蛋白的聚集程度越大[20]。上述結(jié)果表明MGP的熱穩(wěn)定性(Td)和有序聚集程度(ΔH)都大于MGPP,即糖基化有助于肽鏈形成有序結(jié)構(gòu),提高肽鏈熱穩(wěn)定性。

2.6 掃描電子顯微鏡分析結(jié)果

圖5為澳洲堅(jiān)果糖肽MGP和肽鏈MGPP在掃描電鏡下放大200和2 000倍的表面形貌圖。在200倍和2000倍掃描電鏡上觀察到MGP有很多疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)周?chē)饣秸?圖5-a,圖5-b),說(shuō)明分子間有相互作用力,能形成緊密而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。與MGP相比,MGPP中緊密有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失(圖5-c、圖5-d),出現(xiàn)一些雜亂無(wú)序的結(jié)構(gòu)。MGP在冷凍干燥后仍能保持有序結(jié)構(gòu)可能是由于糖鏈能夠自身形成糖網(wǎng)絡(luò)[21],可以加固蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使其在冷凍環(huán)境下更加穩(wěn)定。

a-MGP×200；b-MGP×2000；c-MGPP×200；d-MGPP×2 000圖5 MGP β-消除反應(yīng)前后的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images before and after MGP β-elimination reaction

2.7 抗氧化分析結(jié)果

如圖6所示,隨著MGP質(zhì)量濃度的提高,其DPPH、·OH清除能力和還原能力逐步提高,并有明顯量效關(guān)系,并在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時(shí)分別達(dá)到最大,為60.3%、98.7%、1.45。與MGP相比,MGPP的DPPH清除率顯著降低,最大清除率由60.3%降到20.3%(圖6-a),除去糖鏈后,糖肽空間結(jié)構(gòu)被破壞,疏水基團(tuán)相互結(jié)合,使更多的親水氨基酸暴露,而DPPH是一種油溶性的自由基[12],肽鏈極性增加使它們更難捕獲油溶性的DPPH,導(dǎo)致DPPH的清除能力下降；·OH最大清除率由98.7%降到37.6%(圖6-b),由圓二色譜結(jié)果可知,消除糖鏈后多肽的β-折疊減少而無(wú)規(guī)則卷曲增加,研究發(fā)現(xiàn)β-折疊中的階梯狀結(jié)構(gòu)[6]能夠?qū)⒋蟛糠謿滏I包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi),弱化了·OH對(duì)本身結(jié)構(gòu)的影響,使之有更強(qiáng)的·OH清除能力,與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相符合；最大還原能力由1.4降到0.5(圖6-c),還原能力反映抗氧化劑供電子能力的強(qiáng)弱,有研究表明酸性或堿性氨基酸殘基對(duì)還原能力的影響很大[22],主要是由于這些氨基酸的氨基和羧基參與了金屬離子反應(yīng),使肽鏈供電子能力變差,阻礙了抗氧化反應(yīng)[23]。去糖基化導(dǎo)致肽鏈中的酸性或堿性氨基酸暴露出來(lái),使MGPP的還原能力下降。除了通過(guò)影響肽鏈分子空間結(jié)構(gòu),抗氧化活性的降低還可能與糖肽中糖鏈本身即具有抗氧化及清除自由基的能力有關(guān)。綜上所述,MGP具有較好的抗氧化活性,其結(jié)構(gòu)上的O-糖基化有助于提高和穩(wěn)定澳洲堅(jiān)果糖肽的抗氧化活性。

a-DPPH自由基清除率；b-·OH的清除率；c-總還原力圖6 MGP和MGPP的體外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant effects of MGP and MGPP in vitro

3 結(jié)論

本文從澳洲堅(jiān)果油粕中分離純化得到分子質(zhì)量約為12 kDa的澳洲堅(jiān)果糖肽MGP,MGP經(jīng)β-消除后得到分子質(zhì)量約為9 kDa的肽鏈MGPP。研究結(jié)果表明：糖肽MGP為O-型糖苷鍵,其肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)中較MGPP有更多的α-螺旋、β-折疊等有序結(jié)構(gòu),有更高的熱穩(wěn)定性、抗氧化能力和更有序的顯微結(jié)構(gòu)。因此,澳洲堅(jiān)果糖肽的糖基化有助于維持澳洲堅(jiān)果糖肽的空間結(jié)構(gòu),使MGP的結(jié)構(gòu)和性能更加穩(wěn)定,這對(duì)更好地發(fā)揮其多肽的生物功能、更好地利用豐富的動(dòng)植物蛋白資源有重要意義。