歐陽(yáng)文坤，田春陽(yáng)，劉華熙，鄧伊健，趙曉山，孫曉敏

(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 廣州 510515)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一組以IgA或IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)呈顆粒樣或團(tuán)塊樣彌漫性沉積為特征的原發(fā)性腎小球疾病，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。IgAN臨床表現(xiàn)多種多樣，且發(fā)病機(jī)制尚未明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在臨床上至今仍無(wú)對(duì)IgAN有效的特異性治療藥物，但中醫(yī)學(xué)對(duì)IgAN的防治積累了豐富經(jīng)驗(yàn)并且取得顯著療效。在中醫(yī)學(xué)中未找到能直接與IgAN對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)其主要臨床表現(xiàn)和證候，可將其歸于“尿血”“尿濁”“水腫”“腎風(fēng)”等疾病的范疇[1]。

人體腸道菌群參與體內(nèi)代謝過程，其與機(jī)體形成了能相互調(diào)節(jié)的一種動(dòng)態(tài)平衡的共生狀態(tài)[2]。正常情況下，腸黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)腸道菌群呈免疫耐受表現(xiàn)[3]，一旦腸道內(nèi)環(huán)境某些因素異常變化，就會(huì)打破這種共生狀態(tài)，導(dǎo)致疾病發(fā)生。De Angelis等[4]發(fā)現(xiàn)IgAN患者的腸道菌群存在生態(tài)失調(diào)，與健康人相比，IgAN患者糞便中的有益菌數(shù)量明顯減少，而有害菌數(shù)量增多。近年來(lái)Coppo R[5]提出的與IgAN發(fā)病機(jī)制相關(guān)的“腸腎關(guān)聯(lián)”學(xué)說得到廣泛認(rèn)可，其認(rèn)為當(dāng)各種原因?qū)е履c道黏膜免疫功能異常時(shí)，機(jī)體對(duì)食物抗原、腸道菌群等會(huì)出現(xiàn)免疫耐受缺陷，腸道屏障功能下降，腸道中內(nèi)毒素吸收入體增加，激活黏膜相關(guān)淋巴組織，使機(jī)體處于亞臨床炎癥狀態(tài)，從而使異常糖基化IgA1大量產(chǎn)生，形成循環(huán)免疫復(fù)合物增多，最后沉積于腎小球系膜區(qū)，導(dǎo)致IgAN發(fā)生。單純性血尿是IgAN最常見的臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“尿血”范疇，近代醫(yī)家多認(rèn)為脾腎兩虛為其基本病機(jī)，脾虛不能統(tǒng)血，腎虛不能固攝，精血不循常道而外泄，發(fā)為血尿[6]。因此血尿病程日久，多責(zé)之于脾，脾胃學(xué)說是與腸道菌群關(guān)系最為直接的理論之一[7]。中醫(yī)理論“脾為后天之本”，認(rèn)為脾主運(yùn)化水谷精微、化生氣血，中醫(yī)的“脾”在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中是涉及到消化吸收、水鹽代謝、能量轉(zhuǎn)化以及免疫內(nèi)分泌等多系統(tǒng)、多器官的綜合功能單位[8]；這與腸道菌群在后天定植成長(zhǎng)走向成熟的穩(wěn)態(tài)過程及在維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要作用相一致。同時(shí)，中醫(yī)理論“腎為先天之本，脾為后天之本”認(rèn)為腎中精氣的盛衰影響著子代的先天稟賦與生長(zhǎng)發(fā)育，與遺傳物質(zhì)關(guān)系密切；而脾之精氣來(lái)源于水谷精微，其功能易受環(huán)境、飲食影響，脾腎二者先后天相互滋養(yǎng)，功能相互協(xié)同[9]。因此，“腸腎關(guān)聯(lián)”學(xué)說與中醫(yī)證候“脾腎兩虛”的理論實(shí)質(zhì)有密切關(guān)聯(lián)。

本課題組通過多年治療IgAN所創(chuàng)立的健脾益腎經(jīng)驗(yàn)方“腎?、蛱?hào)方”已通過臨床及實(shí)驗(yàn)證明，其對(duì)IgAN有明顯療效[10-13]，其具體機(jī)制尚未明確，因此本研究使用宏基因組學(xué)研究方法，探討腎病Ⅱ號(hào)方治療IgAN大鼠的腸道微生物調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次實(shí)驗(yàn)采用40只4周齡的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量在180-220 g之間，均采購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。飼養(yǎng)時(shí)保持室內(nèi)安靜，空氣相對(duì)濕度控制為40%-60%，溫度控制在22℃-26℃，自由進(jìn)食、水，4只大鼠/籠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及材料

“腎病Ⅱ號(hào)方”藥物組成為：熟地20 g、山藥30 g、山萸肉20 g、白茅根30 g、大小薊20 g、煅牡蠣30 g、炙甘草5 g。所用中藥飲片購(gòu)自南方醫(yī)院中藥房，按照(熟地：山藥：山萸肉：白茅根：大小薊：煅牡蠣：炙甘草=4∶6∶4∶6∶4∶6∶1)的藥物比例制作復(fù)方濃縮液。本實(shí)驗(yàn)中“腎病Ⅱ號(hào)方”灌胃濃度分為低、中、高劑量3種，將臨床單日的用藥量(熟地20 g、山藥30 g、山萸肉20 g、白茅根30 g、大小薊20 g、煅牡蠣30 g、炙甘草5 g)作為中劑量，低劑量濃度為中劑量二分之一，高劑量濃度為中劑量?jī)杀叮缓蟀凑账幚韺W(xué)體表面積來(lái)?yè)Q算，得出腎?、蛱?hào)方的低、中、高劑量的灌藥濃度分別為：1 g·kg-1、2 g·kg-1、4 g·kg-1(此處為熟地劑量)。

牛血清白蛋白(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；脂多糖(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；四氯化碳(上海阿拉丁生化科技股份供銷公司)；肌酐檢測(cè)試劑盒、尿素氮檢測(cè)試劑盒、尿蛋白檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)；TransGen AP221-02(TransStart Fastpfu DNA Polymerase)；PCR儀(ABIGeneAmp?9700型)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)。

1.3 分組及造模

本實(shí)驗(yàn)分組共分為5組。將40只SD大鼠按8只/組來(lái)隨機(jī)分為以下5組：正常組，模型組，腎病Ⅱ號(hào)方低、中、高劑量組。本次實(shí)驗(yàn)的造模方法[14]采用異種蛋白免疫誘導(dǎo)模型，本課題組對(duì)其調(diào)整了一些劑量，并進(jìn)行整合、優(yōu)化，具體造模操作如下：①使用牛血清白蛋白(BSA)對(duì)SD大鼠以600 mg·kg-1進(jìn)行隔天灌胃；②同時(shí)，每周一次在皮下分別注射四氯化碳(CCl4)0.1 mL和蓖麻油(0.5 mL)；③分別在第7、10、13周這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)在SD大鼠的尾靜脈以0.25 mg·kg-1的劑量每周一次來(lái)注射脂多糖(LPS)。整個(gè)造模過程一共持續(xù)15周。對(duì)于模型組，腎?、蛱?hào)方低、中、高劑量，這4組采用上述方法造模，而正常組組則灌胃等量的純凈水并且腹腔注射等量的生理鹽水。從第15周開始，腎?、蛱?hào)方低、中、高劑量組按不同藥物濃度每日灌胃腎?、蛱?hào)方濃縮液，持續(xù)6周，正常組、模型組每日灌胃等量純凈水，持續(xù)6周。

1.4 樣本收集

從使用異種蛋白免疫誘導(dǎo)模型到第15周造模完成后，用代謝籠開始采集大鼠的24 h尿液，每周1次，用試劑盒檢測(cè)尿蛋白肌酐比(PCR)、24 h尿蛋白濃度。

在用腎?、蛱?hào)方中藥濃縮液灌胃6周后，即在第21周實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，用水合氯醛來(lái)麻醉。使用促凝管在大鼠用腹主動(dòng)脈采集得到的血液樣本收集起來(lái)，使用試劑盒檢測(cè)血肌酐、血尿素氮。

采血后取左腎置4%多聚甲醛固定液處理后，石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)病理切片，制作4μm厚連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

取盲腸中的糞便按照E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書對(duì)大鼠糞便樣本進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量。用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 uL，包括4ul 5*FastPfu緩沖液、2 uL 2.5 mM dNTPs、0.8 uL引物(5 uM)、0.4 uL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit說明書進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，去除無(wú)法拼接的序列。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDPclassifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%[15]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況檢測(cè)

正常組精神狀態(tài)較好，活動(dòng)較多，動(dòng)作靈活，其毛發(fā)色澤整齊光亮，大小便均正常，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)其進(jìn)行操作時(shí)其應(yīng)激反應(yīng)較小。

模型組整體出現(xiàn)倦怠、嗜睡、精神萎靡狀態(tài)，活動(dòng)較少，毛發(fā)色澤疏松黯淡，小便顏色偏黃，大便正常，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)其進(jìn)行操作時(shí)其應(yīng)激反應(yīng)大。

腎病Ⅱ號(hào)方低中高劑量3組在給藥干預(yù)之后，精神狀態(tài)在整體上有所恢復(fù)，活動(dòng)較造模過程中變多，動(dòng)作靈活，毛發(fā)較整齊，小便色偏清，大便正常，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)其進(jìn)行操作時(shí)其應(yīng)激反應(yīng)仍然較大。

2.2 血液檢測(cè)

2.2.1 腎功能

如表1、圖1所示，與正常組相比，模型組的尿素氮(BUN)與血肌酐(Cr)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，腎?、蛱?hào)方高劑量組的尿素氮與血肌酐有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而腎?、蛱?hào)方低、中劑量組這兩組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腎功能比較

2.3 尿液檢測(cè)

2.3.1 尿蛋白肌酐比(PCR)

如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組PCR升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，腎病Ⅱ號(hào)方高劑量組PCR顯著降低(P＜0.05)。而腎?、蛱?hào)方低、中劑量組這兩組的PCR與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠PCR比較

2.3.2 24 h尿蛋白定量

如表3、圖3所示，在第15周使用腎?、蛱?hào)方干預(yù)前，模型組及腎?、蛱?hào)方組低、中、高劑量組的24h尿蛋白定量均顯著高于正常組(P＜0.05)。而給藥干預(yù)后，在第19-21周，腎?、蛱?hào)方高劑量組的24 h尿蛋白定量顯著低于模型組(P＜0.05)，呈明顯恢復(fù)趨勢(shì)。而腎?、蛱?hào)方低、中劑量組這兩組的24 h尿蛋白定量與模型組相比無(wú)顯著性差異，下降趨勢(shì)不夠明顯。

圖1各組大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平比較

圖2各組大鼠尿蛋白肌酐比(PCR)水平比較

表3 各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量比較

圖3 各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量比較

2.4 腎臟組織病理學(xué)

由圖4可見，在光鏡下，正常組大鼠的腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見明顯病理改變。模型組可見腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞輕度增生，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹。與模型組相比，腎?、蛱?hào)方低、中劑量組呈現(xiàn)相似病理改變；腎病Ⅱ號(hào)方高劑量組的系膜細(xì)胞增生有所減輕，系膜基質(zhì)較模型組有所減輕，腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。

圖4 各組大鼠腎組織HE染色病理學(xué)觀察

Amplified region 338F_806R Samples 22 Sequences 1232698 Bases/bp 537126141 Averagelength/bp 435.73

2.5 測(cè)序結(jié)果和OTU分布

根據(jù)上述血液檢測(cè)、尿液檢測(cè)和病理改變的結(jié)果來(lái)看，腎?、蛱?hào)方高劑量組大鼠的尿蛋白、腎功能及組織病理變化較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而中劑量及低劑量大鼠與模型組未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故腸道菌群檢測(cè)實(shí)驗(yàn)部分僅對(duì)空白組、模型組、腎病Ⅱ號(hào)方高劑量組這3組大鼠的糞便樣本進(jìn)行菌群分析。

如表4所示，本次實(shí)驗(yàn)共22個(gè)樣本，得到1232698條序列，537126141個(gè)堿基，經(jīng)比對(duì)后的平均長(zhǎng)度為435.73bp。

Venn圖[16]用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所獨(dú)有和共有的OTU數(shù)目，能比較直觀地表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成的相似性及重疊情況。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)OTU聚類后得到831個(gè)OTU。如圖5所示，3組共有705個(gè)OTU，正常組和模型組共有740個(gè)OTU，模型組和高劑量組共有729個(gè)OTU。

圖5 Venn圖

2.6 α多樣性分析

α多樣性用來(lái)反映微生物群落的豐度和多樣性。評(píng)價(jià)菌群豐度的指標(biāo)有Ace指數(shù)、Chao指數(shù)，都用以估計(jì)群落中所含OTU數(shù)目。評(píng)價(jià)菌群多樣性的指標(biāo)有Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，都用以評(píng)估菌群的群落多樣性，值越大說明群落多樣性越高。如表5、圖6所示，3組之間的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖6 α多樣性指標(biāo)

稀釋曲線可以用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐度，用來(lái)說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。如圖7所示，所有樣本曲線趨于平緩，表明本實(shí)驗(yàn)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

圖7 稀釋曲線

2.7 β多樣性分析

β多樣性指樣本間物種多樣性，能反映每個(gè)組內(nèi)各個(gè)樣本的物種組成差異大小。PCoA分析，即主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis)，是利用距離表征β多樣性的指標(biāo)，可用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性。PCoA圖中的橫、縱坐標(biāo)軸刻度是相對(duì)距離，并無(wú)實(shí)際意義，圖中的點(diǎn)之間的距離越大則β多樣性越大，物種組成差異也就越大。如圖8的PCoA主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，能看到正常組、模型組和高劑量組3組的群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

圖8 腸道樣本PCoA分析圖

分組正常組模型組高劑量組Ace 626.25±33.32 619.67±28.47 630.38±43.22 Chao 633.50±41.87 637.00±32.47 632.25±45.07 Shannon 4.65±0.10 4.37±0.28 4.46±0.28 Simpson 0.0241±0.0041 0.0405±0.0168 0.0394±0.0189

本實(shí)驗(yàn)分析3組間的群落組成差異采用PERMANOVA，并且分別基于Bray-Curtis Index、Jaccard Index和Jensen-Shannon Divergence的PCoA來(lái)分析三組的群落結(jié)構(gòu)的聚集情況，如圖9所示，3組的群落結(jié)構(gòu)之間有顯著差異(Bray-Curtis Index：F-value=2.3772，R-squared=0.20015，P-value＜0.002；Jaccard Index：F-value=1.937，R-squared=0.16937，pvalue＜0.002；Jensen-Shannon Divergence：F-value=3.5334，R-squared=0.2711，P-value＜0.001)。

圖9 Bray-Curtis Index(左)；Jaccard Index(中)；Jensen-Shannon Divergence(右)

由此可見，3組間的群落結(jié)構(gòu)能夠顯著區(qū)分，并且腎病II號(hào)方高劑量組的群落結(jié)構(gòu)介于正常組和模型組的群落結(jié)構(gòu)之間，有向正常組恢復(fù)的趨勢(shì)。

2.8 群落結(jié)構(gòu)組分圖

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果來(lái)明確3組樣本在門、屬水平上的分類學(xué)比對(duì)情況，得知3組樣本中含有何種微生物以及各微生物的相對(duì)豐度。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，觀測(cè)3組樣本在門、屬水平上的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)比3組樣本的群落結(jié)構(gòu)，觀測(cè)其變化情況。

2.8.1 菌門水平

腸道菌群結(jié)構(gòu)直方圖展示了微生物種類及其相對(duì)豐度，所有樣本可分類到個(gè)8菌門，在各組中Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)均占據(jù)97%以上(圖10)。

圖10 門水平菌群結(jié)構(gòu)組成

與正常組相比，模型組的Firmicutes(厚壁菌門)豐度顯著減少(P＜0.05)，Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)豐度增多(P＞0.05)，Actinobacteria(放線菌門)和Cyanobacteria(藍(lán)藻門)豐度顯著增多(P＜0.05)(表6)。

表6 菌門結(jié)構(gòu)組成

與模型組相比，腎病II號(hào)方高劑量組的Firmicutes(厚壁菌門)豐度增多(P＞0.05)，Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)豐度減少(P＞0.05)，Tenericutes(柔膜菌門)豐度顯著增多(P＜0.05)，以上菌門有向正常組恢復(fù)趨勢(shì)。

2.8.2 菌屬水平

如圖11所示，在所有樣本中均檢測(cè)出Muribaculaceae_norank、 Lachnospiraceae_NK4A136_group(毛螺菌屬)、Lachnospiraceae_unclassified(毛螺菌屬)、Allobaculum(支原體科)、Desulfovibrionaceae_uncultured(脫硫弧菌科)、Romboutsia，這6種菌屬的豐度之和在每個(gè)樣品中都超過了50%。

圖11 屬水平菌群結(jié)構(gòu)組成

2.9 LEfSe分析

LEfSe(LDA Effect Size)[17]是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的軟件，能夠用于發(fā)現(xiàn)兩組或多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征，以及這些特征對(duì)組間差異的影響程度[18]。LEfSe能確定各組之間具有顯著差異的細(xì)菌類群。LEfSe分析主要有3大步驟：1.利用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)不同組之間的物種豐度差異，找到在豐度上有顯著差異的物種；2.使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)上一步的差異物種在不同組間子分組中的差異一致性；3.最后運(yùn)用線性判別分析(LDA)估計(jì)這些差異物種豐度對(duì)組間差異效果影響的大小。LDA分值越大，代表物種豐度對(duì)差異效果影響越大。

圖12是聚類樹圖，紅色、綠色和藍(lán)色區(qū)域分別表示正常組、模型組和高劑量組。樹枝中的紅色、綠色和藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別表示在各自組別中起重要作用的微生物類群，而黃色節(jié)點(diǎn)則表示在三組中均沒起重要作用的微生物類群。聚類樹圖中的英文字母表示的物種名稱在圖的下方展示。從里圈往外圈看，依次是門、綱、目、科、屬水平的物種。

圖12 3組腸道樣本的聚類樹圖(LDA＞2.0，P＜0.05)

本研究采用LEfSe分析來(lái)確定各組之間具有顯著差異的細(xì)菌類群。如圖13所示，本次研究在正常組發(fā)現(xiàn)16個(gè)分類群，模型組發(fā)現(xiàn)8個(gè)分類群，腎病II號(hào)方高劑量組發(fā)現(xiàn)61個(gè)分類群。

圖13 3組樣本中有顯著作用的菌群LDA分值直方圖(LDA＞2.0，P＜0.05)

正常組在 Clostridiales(梭桿菌目)、Lachnospiraceae(毛螺旋菌科)、Firmicutes(厚壁菌門)等類群的豐度較高。模型組在Gammaproteobacteria(變形桿菌綱)、Coprococcus_2(糞球菌屬)、Bacteroidales_g_unclassified(擬桿菌屬)等類群的豐度較高。高劑量組在Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、Parasutterella、Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)等類群的豐度較高。

3 討論

本課題組所創(chuàng)健脾益腎經(jīng)驗(yàn)方“腎?、蛱?hào)方”藥物組成為：熟地、山藥、山萸肉、白茅根、大小薊、煅牡蠣、炙甘草。方中熟地為補(bǔ)腎滋陰要藥，填精益髓；山藥補(bǔ)氣滋陰，平補(bǔ)脾腎；山萸肉補(bǔ)腎澀精；三者構(gòu)成六味地黃丸中的“三補(bǔ)”，具有補(bǔ)腎填精作用。方中白茅根涼血止血，清熱利尿；大小薊涼血止血，散瘀利尿；一起合用能增強(qiáng)涼血止血之功。煅牡蠣固澀斂陰，能增強(qiáng)山萸肉補(bǔ)腎滋陰固精之力。炙甘草調(diào)和諸藥。本研究使用腎?、蛱?hào)方中藥濃縮液干預(yù)IgA腎病大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎?、蛱?hào)方可有效改善IgA腎病模型大鼠腎功能及腎臟病理?yè)p傷。

在腸道菌群實(shí)驗(yàn)中，使用16SrRNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)在IgA腎病大鼠中腎?、蛱?hào)方對(duì)腸道菌群的影響。通過β多樣性分析我們發(fā)現(xiàn)正常組、模型組、腎?、蛱?hào)方高劑量組三組間的群落結(jié)構(gòu)能夠顯著區(qū)分，并且腎病II號(hào)方高劑量組的群落結(jié)構(gòu)介于正常組和模型組的群落結(jié)構(gòu)之間，有向正常組恢復(fù)的趨勢(shì)。通過LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)在模型組中，顯著差異類群包括Gammaproteobacteria(變形桿菌綱)、Coprococcus_2(糞球菌屬)和Bacteroidales_g_unclassified(擬桿菌屬)，說明它們可能在IgA腎病的發(fā)病中起重要作用，有學(xué)者[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)變形桿菌綱的革蘭陰性菌增多時(shí)，可通過破壞腸道黏膜屏障功能，增加腸道通透性，使內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)增多；腎病Ⅱ號(hào)方高劑量組的顯著差異類群

包括Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、Parasutterella和Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)，表明它們可能在腎?、蛱?hào)方對(duì)IgA腎病發(fā)揮干預(yù)作用的過程中起重要作用，有研究表明[20-21]雙岐桿菌能夠酸化腸道內(nèi)環(huán)境，能夠抑制病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，從而保護(hù)腸道屏障，減少內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)。上述結(jié)果說明腎病Ⅱ號(hào)方能夠改變IgA腎病大鼠腸道中的微生物組成。

綜上，腎?、蛱?hào)方可有效改善IgA腎病大鼠腎功能及腎臟病理?yè)p傷，IgA腎病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化，IgA腎病的發(fā)病可能跟這些顯著差異的細(xì)菌有關(guān)，而腎?、蛱?hào)方可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來(lái)起到治療IgA腎病的作用。目前調(diào)控腸道菌群失調(diào)已成為治療的新靶點(diǎn)，大量研究[23-26]發(fā)現(xiàn)益生菌具有免疫調(diào)節(jié)作用，能增強(qiáng)腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素入血，改善機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)，延緩腎病進(jìn)展；而Chemouny等[27]通過口服抗生素調(diào)節(jié)菌群來(lái)治療人源化IgA腎病小鼠。盡管近年來(lái)相關(guān)研究較多，但各類腸道菌群的功能及其驅(qū)動(dòng)IgA腎病發(fā)病的機(jī)制尚未完全明了。本研究?jī)H就腎?、蛱?hào)方對(duì)IgA腎病大鼠模型腸道菌群的變化情況進(jìn)行了檢測(cè)，并未能深入探討此類變化在IgA腎病發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制，以及中藥復(fù)方成分在此過程中的確切作用。因此未來(lái)的研究將繼續(xù)以腸道菌群為治療靶點(diǎn)，擬用無(wú)菌小鼠和宏基因組學(xué)技術(shù)結(jié)合，探究特定菌群具體的上下游通路機(jī)制，明確其在IgA腎病發(fā)病中的作用，為治療IgA腎病的研究提供新思路。